Σχέση δομής-λειτουργίας και μεταγραφική ρύθμιση της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι του ανθρώπου

Abstract

In order to investigate how structural mutations in apoA-I affect the biogenesis and the plasma levels of high density lipoprotein (HDL) and explain the etiology of genetically determined low levels of HDL, I have generated recombinant adenoviruses expressing naturally occurring and bioengineered mutations of apolipoprotein A-I and studied their properties in vitro and in vivo. The naturally occurring mutants apoA-I(Leu141Arg)Pisa, apoA-I(Leu159Arg)FIN, apoAI(Arg151Cys)Paris and apoA-I(Arg160Leu)Oslo as well as the bioengineered mutant apoAI(Arg149Ala) were secreted efficiently from cells in culture. The capacity of the mutant proteins to activate LCAT in vitro was greatly reduced to 0.41%, 2.07%, 28.4%, 2.7% and 5.2% of that of the WT apoΑ-Ι, respectively, in vitro and their ability to promote ABCA1-mediated cholesterol efflux from macrophages was similar to that of the WT apoA-I protein. Gene transfer of the mutants in apoA-I deficient (apoA-I-/-) mice generated aberrant HDL phenotypes. Mice expressing the apoΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa or apoΑ-Ι(Leu159Arg)FIN mutants had almost 90% decrease in plasma HDL-cholesterol and apoA-I levels (85% and 91% for apoΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa, and 89% and 87% for apoΑ-Ι(Leu159Arg)FIN, respectively), compared to those of mice expressing the WT apoΑ-Ι. apoA-/- mice expressing apoA-I(Arg160Leu)Oslo, apoA-I(Arg149Ala) and apoA-I(Arg151Cys)Paris mutants had a reduction in HDL levels by 78%, 59% and 61% while the apoA-I levels were reduced by 68%, 64% and 55%, respectively, as compared to mice expressing the WT apoA-I. The cholesteryl ester to total cholesterol (CE/TC) ratio of HDL from mice expressing any of the five mutants was significantly decreased and the apoA-I was distributed in the HDL3 region. Similar experiments for the mutant apoA-I(Leu178Pro) showed no difference in the phenotype produced by the mutant compared to the one produced by the WT apoA-I. The expression of mutants apoΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa or apoΑ-Ι(Leu159Arg)FIN in apoA-I-/- mice caused accumulation of preβ1-HDL and small size α4-HDL particles in the plasma and generated only few spherical HDL particles, similar in number to those formed by the control protein GFP. The mutants apoA-I(Arg160Leu)Oslo and apoA-I(Arg149Ala) promoted the formation of preβ1 and mainly α4-HDL subpopulations and gave a mixture of discoidal and spherical particles. Interestingly, apoA-I(Arg151Cys)Paris generated subpopulations of different sizes that migrate between preβ and α-HDL and formed mostly spherical and a few discoidal particles. Simultaneous treatment of mice with adenoviruses expressing any of the five mutants and human LCAT normalized plasma apoA-I, HDL cholesterol levels and the CE/TC ratio. It also led to the formation of spherical HDL particles consisting mostly of α-HDL subpopulations with slower electrophoretic mobility. The study establishes that apoA-I(Leu141Arg)Pisa and apoA-I(Leu159Arg)FIN inhibit an early step in the biogenesis of HDL due to inefficient esterification of the cholesterol of the preβ1-HDL particles by the endogenous LCAT. On the other hand, the mutants apoA-I(Arg160Leu)Oslo, apoA-I(Arg149Ala) and apoA-I(Arg151Cys)Paris inhibit a later step in the biogenesis of HDL due to inefficient esterification of the cholesterol of the discoidal particles. The correction of the aberrant HDL phenotypes by treatment with LCAT suggests a potential therapeutic intervention for HDL abnormalities that result from specific mutations in apoA-I. Adenovirus-mediated gene transfer of C-terminal apoA-I mutants in apoA-I-/- mice, showed that the plasma HDL levels were greatly reduced in mice expressing the carboxyterminal deletion mutants apoA-I[Δ(185-243)] and apoA-I[Δ(220-243)], shown previously to diminish the ABCA1-mediated lipid efflux. The HDL levels were normal in mice expressing the WT apoA-I, the apoA-I[Δ(232-243)] deletion mutant or the apoAI[E191A/H193A/K195A] point mutant, which promote normal ABCA1-mediated lipid efflux. EM and 2D gel electrophoresis analyses showed that the apoA-I[Δ(185-243)] and apoA-I[Δ(220-243)] mutants formed mainly preβ-HDL particles and few spherical particles enriched in apoE, while WT apoA-I, apoA-I[Δ(232-243)] and apoA-I[E191A/H193A/K195A] formed spherical α-HDL particles. The findings establish that (a) deletions that eliminate the 220-231 region of apoA-I prevent the synthesis of α-HDL but allow the synthesis of preβ-HDL particles in vivo, (b) the amino-terminal segment 1-184 of apoA-I can promote synthesis of preβ-HDL-type particles in an ABCA1-independent process, and (c) the charged residues in the 191-195 region of apoA-I do not influence the biogenesis of HDL. Finally, in order to elucidate the contribution of different transcription factors to the regulation of apoΑ-Ι and apoCIII genes we used a series of recombinant adenoviruses expressing nuclear receptors and members of the TGFβ signaling pathway. Preliminary results indicated that human apoA-I gene expression is negatively regulated, in vivo, by the TGFβ signaling pathway and specifically through SMAD3 protein.

Η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (αποΑ-Ι) είναι η κύρια πρωτεΐνη των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) και παίζει σημαντικό ρόλο στην βιογένεση, τη δομή, την λειτουργία και την συγκέντρωση της HDL στο πλάσμα. Επιδημιολογικές μελέτες και κλινικές δοκιμές φανερώνουν ότι τα επίπεδα της HDL είναι αντιστρόφως ανάλογα του κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου στον άνθρωπο. Για την εξήγηση της μοριακής αιτιολογίας των χαμηλών επιπέδων HDL στον ανθρώπινο πληθυσμό που έχουν γενετική προέλευση, καθώς και για να μελετηθούν οι επιδράσεις δομικών αλλαγών της αποΑ-Ι στην βιογένεση της HDL, δημιουργήθηκαν ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές, αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa, αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN, αποΑ-Ι(Arg151Cys)Paris, αποΑ-Ι(Arg160Leu)Oslo, αποΑ-Ι(Leu178Pro) και αποΑ-Ι(Arg149Ala) και μελετήθηκαν οι ιδιότητές τους, in vitro και in vivo. Όλες οι μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι εκκρίνονταν κανονικά και σε παρόμοια επίπεδα σε κυτταρικές καλλιέργειες. Η ικανότητα των μεταλλαγμένων μορφών αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa, αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN, αποΑ-Ι(Arg151Cys)Paris, αποΑ-Ι(Arg160Leu)Oslo, και αποΑ-Ι(Arg149Ala) να επάγουν ABCA1-εξαρτώμενη έξοδο χοληστερόλης από καλλιέργειες μακροφάγων ήταν φυσιολογική ενώ εμφάνισαν δραματικά μειωμένη ικανότητα ενεργοποίησης της ακυλτρανσφεράσης λεκιθίνης: χοληστερόλης (LCAT), στο 0.41%, 2.07%, 28.4%, 2.7% και 5.2% της ικανότητας που εμφανίζει η αγριού τύπου (WT) αποΑ-Ι, σε in vitro πειράματα. Για την κατανόηση της φυσιολογικής σημασίας των ιδιοτήτων των μεταλλαγμένων μορφών της αποΑ-Ι, χρησιμοποιήθηκε μεταφορά γονιδίων μέσω αδενοϊών σε επίμυες με έλλειψη αποΑ-Ι (αποΑ-Ι-/-), η οποία οδήγησε σε διακριτούς φαινότυπους στα εν λόγω πειραματόζωα. Επίμυες που μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένους αδενοϊούς που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa και αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN παρουσίασαν τον βαρύτερο φαινότυπο και εμφάνισαν μειωμένα επίπεδα χοληστερόλης και αποΑ-Ι πρωτεΐνης στο πλάσμα, 85% και 91%, αντίστοιχα, για την αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa, και 89% και 87%, αντίστοιχα, για την αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN, σε σχέση με επίμυες που εκφράζουν την WT αποΑ-Ι. Επίμυες που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές αποΑ-I(Arg151Cys)Paris, αποΑ-Ι(Arg160Leu)Oslo, και αποΑ-Ι(Arg149Ala) εμφανίζουν μείωση στην χοληστερόλη του πλάσματος κατά 78%, 59% και 61% και στην αποΑ-Ι κατά 68%, 64% και 55%, αντίστοιχα, σε σχέση με επίμυες που εκφράζουν την WT αποΑ-Ι. Ο λόγος εστέρων χοληστερόλης προς ολική χοληστερόλη (CE/TC) στο πλάσμα των επίμυων που εκφράζουν οποιαδήποτε από τις πέντε μεταλλαγμένες μορφές ήταν σημαντικά μειωμένος και η κατανομή της αποΑ-Ι ήταν μετατοπισμένη προς μεγαλύτερης πυκνότητας HDL (HDL3). Παρόμοιες μελέτες για την μεταλλαγμένη μορφή αποΑ- Ι(Leu178Pro) έδειξαν ότι η έκφρασή της σε αποΑ-Ι-/- επίμυες οδηγεί σε φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που παρατηρείται από την έκφραση της WT αποΑ-Ι. Οι μορφές αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa και αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN δημιούργησαν preβ- και α4-HDL σωματίδια, και οδήγησαν στο σχηματισμό λίγων σφαιρικών HDL σωματιδίων που ήταν παρόμοια σε αριθμό με αυτά που σχηματίζονται σε επίμυες που εκφράζουν την πρωτεΐνη ελέγχου GFP. Οι αποA-I(Arg160Leu)Oslo και apoA-I(Arg149Ala) δημιούργησαν κυρίως preβ- και α4-HDL σωματίδια και οδήγησαν στον σχηματισμό ενός μείγματος δισκοειδών και σφαιρικών HDL σωματιδίων. Η αποA-I(Arg151Cys)Paris δημιούργησε υποπληθυσμούς σωματιδίων διαφορετικών μεγεθών με κινητικότητα μεταξύ preβ and α-HDL και οδήγησε στο σχηματισμό κυρίως σφαιρικών αλλά και λίγων δισκοειδών σωματιδίων HDL. Ταυτόχρονη χορήγηση αδενοϊών που εκφράζουν οποιαδήποτε από τις πέντε μεταλλαγμένες μορφές μαζί με αδενοϊούς που εκφράζουν την ανθρώπινη πρωτεΐνη LCAT επανέφερε σε φυσιολογικά επίπεδα την αποΑ-Ι, αύξησε σε κανονικά επίπεδα την HDL-χοληστερόλη και τον λόγο CE/TC του πλάσματος. Επίσης, οδήγησε στο σχηματισμό μόνο σφαιρικών σωματιδίων HDL που αποτελούνταν από υποπληθυσμούς α-HDL κινητικότητας. Οι διακριτοί φαινότυποι που παρατηρήθηκαν από τις διάφορες μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι, φανερώνει ότι οι αποΑ-Ι(Leu141Arg)Pisa και αποΑ-Ι(Leu159Arg)FIN αναστέλλουν ένα πρώιμο βήμα της βιογένεσης της HDL που προηγείται του σχηματισμού δισκοειδών σωματιδίων HDL, και οφείλεται σε ανεπαρκή εστεροποίηση της χοληστερόλης των preβ-σωματιδίων. Αντιθέτως, οι μεταλλαγμένες μορφές αποAI( Arg160Leu)Oslo, apoA-I(Arg149Ala) και αποA-I(Arg151Cys)Paris αναστέλλουν ένα αργότερο βήμα του μονοπατιού βιογένεσης της HDL που αναστέλλει την ωρίμανση των δισκοειδών σωματιδίων σε σφαιρικά, λόγω ανεπαρκούς εστεροποίησης της χοληστερόλης των δισκοειδών σωματιδίων. H διόρθωση των παθολογικών φαινοτύπων της HDL, μετά από χορήγηση LCAT, υποδεικνύει πιθανές θεραπευτικές προσεγγίσεις για την διόρθωση των χαμηλών επιπέδων HDL που οφείλονται σε συγκεκριμένες μεταλλάξεις της αποΑ-Ι. Σε άλλα πειράματα, μελετήθηκε ο ρόλος της καρβοξυτελικής περιοχής της αποΑ-Ι στην βιογένεση της HDL. Χρησιμοποιήθηκε μεταφορά μέσω αδενοϊών για μεταλλαγμένες μορφές με ελλείμματα στο καρβοξυτελικό άκρο της αποΑ-Ι, σε αποΑ-Ι-/- επίμυες. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι τα επίπεδα της HDL του πλάσματος μειώθηκαν σε ποντίκια μολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν τις ελλειμματικές μορφές αποΑ-Ι[Δ(185-243)] και αποΑ-Ι[Δ(220-243)]. Αντίθετα, η HDL βρέθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα σε ποντίκια μολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν την ελλειμματική μορφή αποΑ-Ι[Δ(232-243)] ή την μεταλλαγμένη μορφή αποΑ-Ι(Ε191Α/Η193Α/Κ195Α), η οποίες βρέθηκε οτι επάγουν ABCA1-εξαρτώμενη έξοδο χοληστερόλης σε φυσιολογικά επίπεδα. Ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και ηλεκτροφόρηση σε δύο διαστάσεις έδειξε ότι οι ελλειμματικές μορφές αποΑ-Ι[Δ(185-243)] και αποΑ-Ι[Δ(220-243)] οδήγησαν στο σχηματισμό κυρίως preβ-HDL και λίγων σφαιρικών σωματιδίων που περιείχαν κυρίως αποΕ, ενώ η WT αποΑ-Ι, η αποΑ-Ι[Δ(232-243)] και η αποΑ-Ι(Ε191Α/Η193Α/Κ195Α) οδήγησαν στο σχηματισμό σφαιρικών σωματιδίων α-HDL. Τα ευρήματα αυτά φανερώνουν ότι: (α) μορφές της αποΑ-Ι στις οποίες λείπει η περιοχή των αμινοξέων 220-231 εμποδίζουν το σχηματισμό α-HDL αλλά επιτρέπουν το σχηματισμό preβ-HDL σωματιδίων, in vivo, (β) η αμινοτελική περιοχή της αποΑ-Ι, 1-184, μπορεί να επάγει την σύνθεση preβ-HDL σωματιδίων, ανεξάρτητα από τον ABCA1, και (γ) τα φορτισμένα αμινοξέα της περιοχής 191-195 της αποΑ-Ι δεν φαίνεται να επηρεάζουν την βιογένεση της HDL. Τέλος, για να μελετηθεί ο ρόλος συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων στην ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών αποΑ-Ι και αποCIII κατασκευάστηκε μια σειρά ανασυνδυασμένων αδενοϊών που εκφράζουν πυρηνικούς υποδοχείς και μέλη του σηματοδοτικού μονοπατιού TGFβ. Προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου της αποΑ-Ι του ανθρώπου μειώνεται, in vivo, μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού TGFβ και συγκεκριμένα μέσω της πρωτεΐνης SMAD3.