Μελέτη του ρόλου της FKN και του υποδοχέα της CX3CR1 στην δημιουργία αθηρωματικής βλάβης σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο, συσχετισμός της νόσου με γενετικούς πολυμορφισμούς

Abstract

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of the vascular wall. It is mainly preceded through interaction of monocytes with endothelial cells, and involves chemokine signalling and adhesion molecule responses on both types of cells. Several chemokine ligands and receptors have been extensively investigated and have been proved to be involved in a more disease-specific way in atherosclerosis. Chemokines are low molecular weight chemoattractant cytokines known to be major regulatory proteins in leukocyte trafficking and activation. They consist of an expanding family of approximately 50 ligands and 20 receptors which are classified into four subgroups. Chemokines are involved in almost every inflammatory response and play an important role in the pathogenesis of a wide variety of infectious and inflammatory diseases, such as, atherosclerosis. Indeed, recent evidence suggests a pivotal role of chemokines in important aspects of atherogenesis, thus rendering them potential therapeutic target of coronary artery disease (CAD). Fractalkine, the only member of the CX3C sub-family, has been implicated in atherogenesis, since it can act both as a chemotactic agent recruiting monocytes and T-cells in the site of inflammation, and as an adhesion molecule contributing to the diapedesis of leukocytes in inflamed tissues. The receptor of fractalkine (CX3CR1) is a seven transmembrane domain G protein-coupled receptor, and fractalkine binds to it with high affinity, activating intracellular signalling and directly mediating monocyte adhesion. Through its unique structural and functional characteristics, fractalkine is a “perfect” candidate for an exceptional role in the pathogenesis of atherosclerosis. In the present study, we investigated the potential role of fractalkine in atherosclerosis in two different settings. By applying a population genetic study we evaluated the impact of functional polymorphisms in the CX3CR1 gene on susceptibility to coronary artery disease. Then using an in vitro cell-culture model we evaluated the expression of CX3CR1 in the presence or absence of inflammatory stimuli and after treatment with agents with established anti-inflammatory properties. Two single nucleotide polymorphisms have been described in the DNA sequence of the CX3CR1 gene: V249I and T280M. The latter polymorphism has been associated with reduced affinity of the receptor for its ligand. We evaluated the frequency of the above two polymorphisms along with three common polymorphisms of chemokine ligands and receptors (CCR2-64I, CCR5-Δ32, SDF1-3’A) in 210 angiographically diagnosed CAD patients and 165 controls with normal coronary arteries. We constructed haplotypes and combined genotypes. We concluded to a higher frequency of 280M containing genotypes in homozygote or heterozygote state in the control group (24.3 vs. 33.9 p=0.04). We also observed lower severity of CAD –expressed as mean number of diseased vessels- among patients carrying the 280M allele (1.65 ±0.11 vs. 1.94 ±0.07 p=0.03). These results are in agreement with previous observations implicating the presence of the 280M allele with dysfunction of the FKN/CX3CR1 pathway, and indicate its role in the establishment and progression of atherosclerosis. We further evaluated differences in FKN/CX3CR1 activity in patients with CAD and healthy controls. We measured, applying flow cytometry, expression of CX3CR1 in the surface of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from 13 patients with angiographically diagnosed CAD and 13 healthy controls. We observed higher rate of CX3CR1-positive cells in the monocyte gate of patients compared to controls. In order to further explore the possible implication of FKN/CX3CR1 in atherosclerosis we evaluated the CX3CR1 behavior in the presence of inflammatory factors (TNF-α, INF-γ, angiotensin I and angiotensin II) involved in the establishment of the inflammatory micro-environment of the dysfunctional endothelium. Since, activated T-lymphocytes and monocytes/macrophages are the PBMC-subpopulations most actively implicated in atherosclerosis, the expression of CX3CR1 along with the expression of a representative receptor of each major chemokine family (CCR5 and CXCR4) was assessed by flow cytometry in two cell lines (THP-1 monocytes and Jurkat T-lymphocytes) and primary monocytes isolated from healthy donors. Cells were evaluated in naïve state and after treatment with TNF-α, INF-γ, ANG-I and ANG-II. We demonstrated that INF-γ has the ability to significantly increase the CX3CR1 expression of THP-1 monocytes. We did not observe any effect in the fluorescence intensity or the rate of CX3CR1-positive cells in the rest of the studied cellular populations after treatment with the above agents. We further attempted to determine whether angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors could decrease monocyte bioactivity through alteration of CX3CR1 expression. We treated THP-1 cells and primary monocytes with the ACE inhibitors, captopril and lisinopril, and the angiotensin receptor blocker (ARB), losartan. Despite the previously reported multiple anti-atherogenic properties of ACE inhibitors we concluded that both captopril and lisinopril have no effect on THP-1 cells’ and primary monocytes’ chemokine-receptor surface profile. However, ARB losartan significantly increased the rate and fluorescence intensity of CX3CR1-positive primary monocytes. This is a rather unexpected effect since up-regulation of CX3CR1 could not be considered as an anti-atherogenic effect of ARBs. Nevertheless it is still an indication that angiotensin pathway modulators have the ability to alter the chemokine receptor profile of monocytes. In summary, we concluded that dysfunction of the CX3CR1/FKN pathway (mediated by functional polymorphisms of the CX3CR1 gene) reduce susceptibility to CAD. Furthermore, we demonstrated higher rate of CX3CR1-positive monocytes in CAD patients compared to controls. The latter observation could be attributed to increased levels of pre-inflammatory agents such as INF-γ that compose the inflammatory microenvironment of the diseased vessel. The present data underline the role of the FKN/CX3CR1 pathway in the inflammatory processes involved in atherosclerosis, thus rendering it a potential therapeutic target.

Η αθηροσκλήρωση είναι φλεγμονώδης διαδικασία. Η ανάπτυξη των αθηρωματικών βλαβών είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης κυτταρικών πληθυσμών του περιφερικού αίματος, (κυρίως μονοκύτταρων και Τ-λεμφοκύτταρων), με κυτταρικούς πληθυσμούς του τοιχώματος των αγγείων, (ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα). Προφλεγμονώδεις διαμεσολαβητές, συμμετέχουν στην ενορχήστρωση αυτής της διαδικασίας. Οι χημοκίνες είναι χαμηλού μοριακού βάρους χημειοτακτικές κυτοκίνες με σημαντική ρυθμιστική δράση στην ενεργοποίηση και μετανάστευση των λευκοκυττάρων. Αποτελούν μια επεκτεινόμενη οικογένεια περίπου 50 χημειοτακτικών πρωτεϊνών και 20 υποδοχέων ταξινομημένων σε τέσσερις υπο-οικογένειες. Οι χημοκίνες εμπλέκονται σχεδόν σε κάθε φλεγμονώδη απάντηση και παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια ενός μεγάλου αριθμού φλεγμονωδών νοσημάτων μεταξύ των οποίων και η αθηροσκλήρωση. Η συμμετοχή των χημοκινών σε σημαντικούς μηχανισμούς της αθηρογένεσης καθιστά αυτές και τους υποδοχείς τους πιθανούς μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους στην αντιμετώπιση της στεφανιαίας νόσου. Η fractalkine (FKN) είναι το μοναδικό μέλος της οικογένειας των CX3C χημοκινών. Υπάρχει σε διαμεμβρανική και διαλυτή μορφή. Η διαλυτή FKN αποτελεί έναν ισχυρό χημειοτακτικό παράγοντα για τα μονοκύτταρα και τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα. Ο υποδοχέας της FKN (CX3CR1) αποτελείται από επτά διαμεμβρανικές περιοχές είναι συζευγμένος με G-πρωτεΐνη και έχει υψηλή συγγένεια για την FKN. Η αλληλεπίδραση χημοκίνης/υποδοχέα ενεργοποιεί ενδοκυτταρικά μονοπάτια και μεσολαβεί άμεσα στην προσκόλληση και μετανάστευση των μονοκυττάρων. Μέσω των μοναδικών δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών της, η FKN κατέχει τόσο χημειοτακτικές ιδιότητες όσο και ιδιότητες μορίου προσκόλλησης. Είναι συνεπώς, ιδανικός υποψήφιος για έναν ουσιαστικό ρόλο στην αθηροσκλήρωση. Η αλληλεπίδραση της FKN με τον υποδοχέα της CX3CR1 αποτελεί βιοχημικό μονοπάτι με σημαντικό ρόλο στη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων στον έσω χιτώνα του αγγείου. Διερευνήσαμε τη σχέση FKN/CX3CR1 και στεφανιαίας νόσου με δύο τρόπους. Εφαρμόζοντας γενετική επιδημιολογία αναζητήσαμε την επίδραση πολυμορφισμών που επηρεάζουν την δραστικότητα του FKN/CX3CR1 μονοπατιού στην πιθανότητα εκδήλωσης στεφανιαίας νόσου. Κατόπιν σε in vitro κυτταρικά μοντέλα μελετήσαμε την συμπεριφορά του υποδοχέα της FKN υπό την επίδραση προφλεγμονωδών παραγόντων και φαρμάκων με γνωστή πλειοτρόπο αθηροπροστατευτική δράση. Έχουν περιγραφεί δύο μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στον υποδοχέα της FKN: T280M και V249I. Ο ένας εξ αυτών (Τ280Μ) μειώνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης FKN/CX3CR1. Μελετήσαμε την συχνότητα των δύο πολυμορφισμών (αλλά και τριών ακόμα πολυμορφισμών σε γονίδια χημοκινών και υποδοχέων τους) σε 210 ασθενείς με τεκμηριωμένη αγγειογραφικά ποικίλης βαρύτητας στεφανιαία νόσο και 165 μάρτυρες με φυσιολογικά στεφανιαία αγγεία. Συνθέσαμε απλότυπους και συνδυασμένους γονότυπους. Διαπιστώσαμε μεγαλύτερη συχνότητα των γονοτύπων που περιείχαν το 280M αλλήλιο σε ομόζυγη ή ετερόζυγη μορφή στον υγιή πληθυσμό (24.3 έναντι 33.9, p=0.04). Διαπιστώσαμε επίσης μεταξύ των ασθενών μειωμένη βαρύτητα στεφανιαίας νόσου (εκφραζόμενη από τον μέσο αριθμό αγγείων με βλάβη) στους φέροντες το 280Μ αλλήλιο (1.65 ±0.11 έναντι 1.94 ±0.07 p=0.03). Το αποτέλεσμα είναι απόλυτα συμβατό με προηγούμενες παρατηρήσεις που συσχετίζουν την παρουσία του 280M αλληλίου με δυσλειτουργία του FKN/CX3CR1 μονοπατιού και ενισχύει έμμεσα την θεωρεία τηςσυμμετοχής του τελευταίου στην εγκατάσταση και εξέλιξη των αθηρωματικών βλαβών. Στη συνέχεια θελήσαμε να μελετήσουμε διαφορές στην δραστικότητα του FKN/CX3CR1 μονοπατιού μεταξύ ασθενών με στεφανιαία νόσο και υγιών μαρτύρων. Μετρήσαμε με κυτταρομετρία ροής την επιφανειακή έκφραση του υποδοχέα CX3CR1 σε μονοκύτταρα απομονωμένα από 13 ασθενείς με αγγειογραφικά τεκμηριωμένη στεφανιαία νόσο και 13 υγιείς μάρτυρες. Διαπιστώσαμε μεγαλύτερα ποσοστά CX3CR1-18 θετικών μονοκυττάρων στους στεφανιαίους ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες (35.5±19.3 έναντι 19.8±7.5, p=0.01). Σε δεύτερη φάση διερευνήσαμε πως συμπεριφέρεται ο υποδοχέας CX3CR1 υπό την επίδραση φλεγμονωδών παραγόντων (TNF-α, INF-γ, αγγειοτενσίνη Ι και αγγειοτενσίνη ΙΙ) που συμβάλλουν στην σύνθεση του μικροπεριβάλλοντος του δυσλειτουργούντος αγγείου. Επιλέξαμε δύο κυτταρικούς πληθυσμούς που κυρίως αλληλεπιδρούν με το αγγειακό ενδοθήλιο κατά την δημιουργία των αθηρωματικών βλαβών: περιφερικά μονοκύτταρα (THP-1 κύτταρα αλλά και πρωτογενή μονοκύτταρα απομονωμένα από υγιείς δότες) και Τ-λεμφοκύτταρα (Jurkat κύτταρα). Με την χρήση κυτταρομετρίας ροής διαπιστώσαμε ότι ο η ιντερφερόνη (INF)-γ αυξάνει το ποσοστό των CX3CR1-θετικών κυττάρων στην μονοκυτταρική σειρά THP-1 (45.1±10.1 έναντι. 63.4±9.8, p =0.006). Δεν διαπιστώθηκε καμία επίδραση στο ποσοστό των CX3CR1-θετικών κυττάρων στους λοιπούς κυτταρικούς πληθυσμούς που μελετήθηκαν υπό την επίδραση των τριών παραγόντων. Τέλος θελήσαμε να δούμε αν παράγοντες με πλειοτροπικές αθηροπροστατευτικές δράσεις επηρεάζουν την έκφραση του υποδοχέα CX3CR1 σε μονοκυτταρικούςπληθυσμούς. Χρησιμοποιήσαμε τους ανταγωνιστές του μετατρεπτικού ενζύμου (α-ΜΕΑ), καπτοπρίλη και λισινοπρίλη και τον ανταγωνιστή των ΑΤ1 υποδοχέων της αγγειοτενσίνης, λοσαρτάνη. Δεν διαπιστώσαμε σημαντικές επιδράσεις των α-ΜΕΑ στην επιφανειακή έκφραση του CX3CR1 υποδοχέα σε κύτταρα THP-1 ή μονοκύτταρα απομονωμένα από υγιείς δότες. Μία οριακή αύξηση των CX3CR1-θετικών μονοκυττάρων παρατηρήθηκε 24 ώρες μετά από επώαση με λοσαρτάνη (49.2±3.7 έναντι56.8±1.2, p=0.02). Το τελευταίο φαινόμενο σαφώς δεν μπορεί να συγκαταλεχθεί στις αθηροπροστατευτικές ιδιότητες της λοσαρτάνης. Υποδεικνύει όμως την ικανότητα των φαρμάκων της κατηγορίας αυτής να επιδρούν στην έκφραση των υποδοχέων χημοκινών και κατ’ επέκταση στην δραστικότητα φλεγμονωδών μηχανισμών. Εν κατακλείδι, διαπιστώσαμε ότι η δυσλειτουργία του CX3CR1/FKN βιοχημικού μονοπατιού (όπως επί παρουσίας του 280Μ αλληλίου) μειώνει την πιθανότητα εκδήλωσης στεφανιαίας νόσου. Δείξαμε επίσης ότι ασθενείς με στεφανιαία νόσοπαρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα CX3CR1-θετικών μονοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και ότι το τελευταίο φαινόμενο θα μπορούσε να αποδοθεί στα αυξημένα επίπεδα κυτοκινών όπως η INF-γ που συνθέτουν το φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον του αθηρωματικού αγγείου. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν τον ρόλο της FKN και του υποδοχέα της στους φλεγμονώδεις μηχανισμούς που οδηγούν στην δημιουργία των αθηρωματικών βλαβών και επιβεβαιώνουν το ενδιαφέρον για πιθανή αξιοποίηση τους σαν διαγνωστικούς δείκτες ή θεραπευτικούς στόχους.