Επίδραση δίαιτας ανεπαρκούς σε χολίνη σε θήλεις επίμυες και τα νεογνά τους: μελέτη σε ήπαρ και ωοθήκες: συσχετίσεις με κυτταρικούς δείκτες

Abstract

Choline is an essential nutrient for humans and rodents (2-11, 22 16-4) and it is well known that choline deficient diet causes lipid accumulation in the liver (16-4), followed by cell necrosis and tissue fibrosis (16-49). Choline seems to be particularly important during development (Zeisel and Blusztajn 1994, Blusztajn 1998) and there is need for increased requirements in pregnancy, both for the mother and the fetus (Zeisel 1995). Thus we thought that it would be interesting to investigate the extent of the effect of choline deficient diet on the liver of the offsprings of rats fed with this diet and subsequently to check the possibility of reversing this effect by feeding the offsprings with normal diet. Study design: This is an experimental study of the liver and ovaries of adult female rats and of the liver of offspring that have been fed with a choline deficient diet (CDD). Aim: Since pregnancy and lactation increase body’s needs to choline, our goal was to observe the consequences of a CDD to the ovaries and liver of adult rats, studying the biochemical and histological effects and in the liver of offspring, apart from biochemical and histological consequences, also the changes of cellular proliferation. In offspring we also studied the possible reversibility of liver dysfunction. Materials and methods: Adult female Whistar rats were divided in two groups: a control group (ND) fed on a normal diet (Nd) and a study group (CDD) which received a choline deficient diet (CDd). After one week of acclimatization, both groups received the predetermined diet for 6 wks before mating. The pregnant rats continued on the same diet for 6 more wks. In adults we studied: a) body weight, b) reproductive capability (ovarian morphology, vaginal smear, pregnancy, number of offsprings, c) AST, ALT, ALP serum levels, d) histological examination of the liver (grade of steatosis). In offspring, the grouping was the same as their mothers’, depending on the diet, ND group and CDD group. In the offsprings: (a) AST, ALT, ALP serum levels were measured, (b) liver histology was examined and (c) index of cellular proliferation (cyclins: Dl, E, A, B, Cdkls: pl6, p21, p27 and PCNA) was evaluated. Results: Adults: 1) gradual weight gain in both groups, with greater weight on the CDD group in the 1st and 3 1/2 months. 2) There was no difference in the reproductive capability. 3) After 12 weeks under Cdd we observed in AST and ALT levels in CDD group (<0,5), but no difference in ALP. 4) Steatosis was greater in CDD group in 6 and 12 weeks. In 12th week (delactation), the difference is statistically significant (p<0,001). Offspring: 1) weight was greater in CDD group. 2) ALP showed no differences. AST and ALT, in CDD group, were increased at 6th week, and returned to normal levels towards the 13th week. 3) Both groups presented liver steatosis 3 weeks after the end of lactation (6 weeks of life) with CDD group to show higher levels. Liver morphology was recovered by 10th week in group ND and towards 13th week group. When offsprings from group CDD were turned to Nd after lactation, there was an accelerated recovery of the steatosis. 4) Cyclins A B showed no changes in both groups. The D1 and E of cytoplasm reduced in 6th week in both groups. In contrast, in the nucleus we observed a significant increase of El and D in 6th week in CDD. In 10th week we had a decrease of nuclear D1 and E with the levels of CDD greater than in the ND. P16 raised significantly in 6th week in both ND and CDD with decrease in 10th week. p21 was expressed at high levels in 3rd week, but instead decreased significantly from 6th week in both groups. PCNA it was increased considerably in 6th week in CDD group (p<0.001). Conclusions: Our results show that: a) Lack of choline, mainly during pregnancy and lactation has significant consequences in liver morphology and function. b) Lactation offers protective action. c) the damage reverses in CDD greater than 12th week, at least in morphological level, as also by providing normal diet. d) over expression of cyclins E and D with the conjuctant inhibitors, mainly at Gl phase of cellular cycle, is indicative of arrest of cell cycle at this phase.

Η χολίνη και οι μεταβολίτες της είναι απαραίτητα συστατικά για την δομική και λειτουργική ακεραιότητα των κυτταρικών μεμβρανών και την κυτταρική επικοινωνία,. Επιπλέον η χολίνη επηρεάζει άμεσα διάφορες λειτουργικές διαδικασίες, μεταξύ των οποίων και την μεταφορά και τον μεταβολισμό των λιπιδίων ενώ, συμμετέχει και στην αναπαραγωγική διαδικασία. Η μελέτη αυτή είναι πειραματική μελέτη του ήπατος και των ωοθηκών ενηλίκων θήλεων επιμύων και του ήπατος νεογνών που εξετέθησαν ενδομήτρια σε ανεπαρκή σε χολίνη δίαιτα (CDd), την οποία και εξακολούθησαν μετά τον απογαλακτισμό. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης δίαιτας ανεπαρκούς σε χολίνη (ομάδα CDD) σε σύγκριση με ισορροπημένη δίαιτα (ομάδα ND) α) στην ικανότητα αναπαραγωγής ενηλίκων επιμύων και β) στο ήπαρ ενηλίκων και νεογνών επιμύων προερχομένων από μητέρες υπό δίαιτα ελλιπή σε χολίνη. (εκτίμηση των ηπατικών βλαβών, μακροσκοπικά, μικροσκοπικά και βιοχημικά και η συσχέτιση με δείκτες κυτταρικού κύκλου) γ) έλεγχος της αναστρεψιμότητας των βλαβών. Πειραματόζωα και μέθοδος: Θήλεις επίμυες ράτσας Wistar χωρίσθηκαν σε δύο ομάδες: ομάδα ελέγχου (ND) που έλαβε φυσιολογική τροφή (Nd) και ομάδα μελέτης (CDD), η οποία έλαβε ειδική τροφή ελλιπή σε χολίνη (CDd). Μετά τον εγκλιματισμό και οι δύο ομάδες έλαβαν την προκαθορισμένη δίαιτα επί 6 εβδομάδες πριν την σύζευξη. Οι έγκυες επίμυς συνέχισαν την ίδια δίαιτα για ακόμη 6 εβδομάδες. Στους ενήλικες μελετήθηκαν: α) βάρος σώματος, β) αναπαραγωγική ικανότητα (κολπικό επίχρισμα, αριθμός κυήσεων, μορφολογία ωοθηκών γ) επίπεδα AST,ALT,ALP ορρού, δ) οι ιστοπαθολογικές μεταβολές του ήπατος (βαθμός λίπωσης). Στα νεογνά, ο διαχωρισμός ήταν ίδιος με αυτόν των μητέρων τους, ανάλογα με την τροφή σε ομάδα ND και μάδα CDD Στους απογόνους μελετήθηκαν: α)Επίπεδα AST,ALT,ALP ορρού, β) οι ιστοπαθολογικές μεταβολές του ήπατος (βαθμός λίπωσης). και γ)δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κυκλίνες: D1,E,A,B, Cdkls: pl6, p21, p27 και το PCNA). Αποτελέσματα: Ενήλικες: 1) σταδιακή αύξηση του βάρους και στις δύο ομάδες με μεγαλύτερο βάρος στην ομάδα CDD στο 1 μήνα και στους 3 1/2 μήνες uπό CDd. 2) δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην αναπαραγωγική ικανότητα. 3) Στις 12 εβδομάδες παρατηρήθηκε στην ομάδα CDD αύξηση των AST και ALT (p<.05), ενώ δεν βρέθηκε διαφορά στην ALP. 4) Η λίπωση ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα CDD στις 6 και 12 εβδομάδες. Στην 12η εβδομάδα (απογαλακτισμός), η διαφορά είναι στατιστικά σημαντική (p<.0001). Νεογνά: 1) το βάρος ήταν μεγαλύτερο στην ομάδα CDD. 2) Η ALT και η AST παρουσίασαν στην ομάδα CDD μια αύξηση κατά την 6η εβδομάδα ζωής με επαναφορά στα φυσιολογικά επίπεδα περί την 13η εβδομάδα. Η ALP δεν είχε διαφορές. 3) Λίπωση εμφανίσθηκε και στις 2 ομάδες ND και CDD 3 εβδομάδες μετά το πέρας του απογαλακτισμού. Η λίπωση ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα CDD σε σύγκριση με την ομάδα ND. Αποκατάσταση της ηπατικής μορφολογίας επήλθε στην ομάδα ND περί την 10η εβδομάδα, ενώ η ομάδα CDD περί την 13η εβδομάδα. Χορήγηση φυσιολογικής δίαιτας στα νεογνά που προήρχοντο από μητέρες υπό CDd, μετά τον απογαλακτισμό, επιτάχυνε την αποκατάσταση της ηπατικής βλάβης ενώ αντίθετα χορήγηση CDd σε νεογνά που προήρχοντο από μητέρες υπό Nd, μετά τον απογαλακτισμό, εμφάνισαν αύξηση της λίπωσης. 4) Οι κυκλίνες A και Β δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή και στις δύο ομάδες. Οι κυτταροπλασματικές κυκλίνες D1 και Ε μειώθηκαν κατά την 6η εβδομάδα ζωής και στις δύο ομάδες. Αντίθετα στην ομάδα CDD παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των πυρηνικών D1 (p<.0001) και Ε κατά την 6η εβδ. με μείωση περί την 10η εβδ. Η ανασταλτική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου p16 ήταν σημαντικά αυξημένη την 6η εβδ., και στις δύο ομάδες και μειώθηκε την 10η εβδ. Η ανασταλτική πρωτεΐνη p21 εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα την 3η εβδ. και επίσης μειώθηκε σημαντικά από την 6η εβδ., και στις δύο ομάδες. Το PCNA αυξήθηκε σημαντικά την 6η εβδ., στην ομάδα CDD (p<.0001). Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν ότι: α) Η έλλειψη χολίνης, κυρίως κατά την κύηση και την γαλουχία, επιφέρει σημαντικές επιπτώσεις στην μορφολογία και λειτουργία του ήπατος. β) Ο θηλασμός ασκεί μια προστατευτική δράση, δ) Η ηπατική βλάβη νεογνών εκτεθειμένων ενδομήτρια και κατά το θηλασμό σε δίαιτα ελλιπή σε χολίνη, αναστρέφεται, τουλάχιστον σε μορφολογικό επίπεδο με την χορήγηση ισορροπημένης δίαιτας, ε) παρατηρείται αυξημένη έκφραση των κυκλινών με των αντιστοίχων αναστολέων τους κυρίως της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου καθώς επίσης του PCNA.