Απομόνωση, μοριακός χαρακτηρισμός και φυλογενετική ανάλυση γονιδίων της οικογένειας HSP70 από το είδος Mytilus galloprovincialis, Lamarck 1819

Abstract

The genes of the HSP70 family are considered to be very important. However, they are not well studied in molluscs, which is the second most speciose and the most divergent metazoan phylum. The presence of many species in the phylum adapted in a variety of habitats, show well developed response mechanisms in environmental stimuli, such as the heat shock response system. Mytilus galloprovincialis is a bivalve mollusc bearing such adaptation characteristics and for that reason it was selected as a molluscan representative for the study of the genes of the HSP70 family. The unclear phylogenetic status of the molluscan phylum together with the Mytilus species’ and populations’ discrimination problem, were two additional reasons for the isolation and analysis of genes of the HSP70 family from M. galloprovincialis. A single specimen genomic library was constructed for the isolation of the genes and screened using a PCR-amplified homologous probe that was designed on the single known and partial hsp70 sequence from the sibling species M. edulis. A total of nine clones were isolated and, after restriction mapping, divided in two groups. The first group contains four clones that correspond in two discrete genomic regions with two intron-containing hsp70 sequences, respectively. Nucleotide and amino acid analysis showed that they are constitutive (cognates) cytoplasmic members and were designated as hsc71 and hsc70, respectively. Genomic hybridizations didn’t result in detection of additional homologous sequences. Introns in the fully sequenced hsc71 are five and in both genes were found to contain four different repetitive sequences. These sequences were found to be satellite repeats; one already known (ApaI) and the other three characterized in the present study and designated as MgSat1, MgSat2 and MgSat3. The presence of satellite repeats inside hsp70 introns has not been reported in other species. The hsc71 and hsc70 genes exhibit high sequence similarity, even between their introns that differ only in the number of some satellite repeats, an unusual observation for cognate genes. For that reason it is proposed that they emerged through recent gene duplication or they experience concerted evolution via gene conversion, the latter further reinforced from the presence of satellite repeats. The second group contains five clones that correspond in four genomic regions with four intronless hsp70 sequences, respectively. Sequence analysis showed that they are inducible cytoplasmic members that were designated hsp70-1, hsp70-2, hsp70-3, and hsp70-4. Genomic hybridizations did not result in detection of additional homologous sequences. The four genes are copies bearing high sequence conservation 131 due to concerted evolution via gene conversion and purifying selection. According to their genomic organization and their 5΄ and 3΄ non coding sequences comparison, it is proposed that, initially, there was an ancient gene pair, probably existing before the phylum divergence, which gave birth to the other two genes through more recent gene duplications.

Τα γονίδια της οικογένειας HSP70 παρά τη μεγάλη τους σημασία δεν είναι καλά μελετημένα στα μαλάκια, το δεύτερο πολυπληθέστερο σε αριθμό ειδών και το πλέον ποικιλόμορφο φύλο μεταζώων. Παράλληλα, η παρουσία στα μαλάκια ειδών με προσαρμογή σε ποικίλα περιβάλλοντα, προδιαθέτει για καλά αναπτυγμένους μηχανισμούς απόκρισης σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα, όπως είναι και το σύστημα απόκρισης στο θερμικό σοκ. Το Mytilus galloprovincialis είναι ένα είδος δίθυρου μαλάκιου με αυτά τα χαρακτηριστικά και γι’ αυτό επιλέχθηκε ως αντιπροσωπευτικό είδος από τα μαλάκια για τη μελέτη των γονιδίων της οικογένειας HSP70. Επιπλέον, τόσο η αμφισβητούμενη φυλογενετική θέση των μαλακίων, όσο και η δυσκολία διάκρισης των ειδών και πληθυσμών του γένους Mytilus, αποτέλεσαν μια ακόμα αφορμή για την απομόνωση και ανάλυση των γονιδίων της οικογένειας HSP70 στο M. galloprovincialis. Για την απομόνωση των γονιδίων κατασκευάστηκε γονιδιωματική βιβλιοθήκη από ένα άτομο του είδους, η οποία σαρώθηκε με ομόλογο ανιχνευτή που ενισχύθηκε με PCR με βάση τη μοναδική και μερικώς γνωστή αλληλουχία hsp70 από το συγγενικό είδος M. edulis. Απομονώθηκαν συνολικά εννέα γονιδιωματικοί κλώνοι οι οποίοι χαρτογραφήθηκαν με ενδονουκλεάσες περιορισμού και κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει τέσσερις κλώνους που αντιστοιχούν σε δύο διακριτές γονιδιωματικές περιοχές και περιέχουν αντίστοιχα δύο αλληλουχίες με ιντρόνια. Ανάλυση σε νουκλεοτιδικό και αμινοξικό επίπεδο έδειξε ότι είναι συστατικά (cognates) κυτταροπλασματικά μέλη τα οποία ονομάστηκαν hsc71 και hsc70 αντίστοιχα. Με βάση τους γονιδιωματικούς υβριδισμούς δεν ανιχνεύθηκαν άλλες ομόλογες αλληλουχίες στο είδος. Τα ιντρόνια στο πλήρως αλληλουχημένο hsc71 είναι πέντε, ενώ και στα δύο γονίδια βρέθηκε ότι περιέχουν τέσσερις διαφορετικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες. Οι επαναλήψεις αυτές αποδείχθηκε ότι είναι δορυφορικές, η μία ήδη χαρακτηρισμένη (ApaI), ενώ οι άλλες τρεις χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα μελέτη και ονομάστηκαν MgSat1, MgSat2 και MgSat3. Η παρουσία δορυφορικών αλληλουχιών στο εσωτερικό ιντρονίων hsp70 γονιδίων δεν έχει ως τώρα αναφερθεί σε άλλα είδη. Τα hsc71 και hsc70 εμφανίζουν υψηλή ομοιότητα, ακόμα και στις αντίστοιχες ιντρονικές αλληλουχίες τους, οι οποίες διαφέρουν ουσιαστικά στον αριθμό κάποιων επαναλήψεων, γεγονός ασυνήθιστο για συστατικά γονίδια. Για το λόγο αυτό προτείνεται ότι, είτε προέκυψαν από πρόσφατο γονιδιακό διπλασιασμό, είτε ακολουθούν εναρμονισμένη εξέλιξη μέσω γονιδιακής 127 μετατροπής που ενισχύεται από την παρουσία των δορυφορικών επαναλήψεων.