Τοξικότητα και φαρμακοκινητική της ιβερμεκτίνης και της κεφαλεξίνης στη τσιπούρα, Sparus aurata

Abstract

Five experiments were conducted at the Department of Biology of the University of Patras and at the Institute of Marine Biology of Crete in order to investigate the toxicity and the pharmacokinetic properties of ivermectin and cephalexin in sea bream Sparus aurata. The study was carried out by haematological, serological and hstological analysis which were included measurements of the hematocrit value, haemoglobin Red and White blood Cell counts, Differential White Blood Cell counts, measurements of the concentration of electrolytes, urea, ALP, creatine, glucose in serum of the fish, histological analysis for possible histopathological alterations in liver, kidney, spleen and gastro enteric tract and daily observations of the behavior of the fish. Ivermectin was detected in fish blood and tissues using an indirect Competitive Immunoassay after solid phase extraction of the drug from the tissues, while cephalexin was detected by the use of High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). A neurotoxicity experiment was designed based on the results of the toxicity and pharmacokinetics experiments of ivermectin, in order to investigate the ability of the drug to cross the blood brain barrier of sea bream and accumulate in the brain. Ivermectin presents low and reversible toxicity in sea bream. The most significant side effects of the substance are the decrease of the hematocrit value, the increase of hemoglobin and the number of the white blood cells, the presence of monocytes, the increase of lymphocytes and blood glucose. High concentrations of ivermectin in the blood of sea bream can lead to red cell disruption hemolysis and allergic reactions. In addition, high concentrations of ivermectin (up to 8 times the recommended dose) induced signs of stress in fish such as loss of appetite, abnormal and lethargic swimming and darkening of the coloration. Ivermectin can also easily cross the blood brain barrier and accumulate in the brain of sea bream. The accumulation of the substance initiates one hour post injection reaches considerable concentration in the brain and maintains equilibrium with circulation between brain and blood. Signs of toxicity decline with time and the fish return to normal condition by the end of the experiment. Ivermectin is absorbed rapidly by sea bream after intraperitoneal administration. The maximum peak serum concentration was 308.4 ng ml-1 at 2 hours post treatment. The AUC of ivermectin was 10700 ng h ml-1 and the elimination half-life 15.37 hours, indicating a rapid uptake, high bioavailability and fast elimination of the drug by sea bream. The high concentration of ivermectin at 2 hours post injection confirms the findings concerning the toxicity of the drug. Cephalexin was not toxic to sea bream even when using dosed exceeding 20 times the recommended dose. There were no toxic side effects in the hematology, serology and histology of the fish that could be associated with the use of the drug. The pharmacokinetic properties of cephalexin in sea bream are similar to those observed in other animals. Cephalexin has rapid absorption, distribution and elimination on sea bream. The maximum concentration was 5.41 mg ml-1kg-1 at 1 hour post injection. The elimination half life was 1,83 hours and the AUC was estimated 17.995 mg h kg-1. The results of the present study indicate that both drugs, ivermectin and cephalexin, can be considered safe for use in sea bream culture. Attention should be paid on the therapeutic scheme, adopting doses close to the recommended, especially for ivermectin which, using high doses can provoke neurotoxicity.

Για τη μελέτη της τοξικότητας και της φαρμακοκινητικής της ιβερμεκτίνης και της κεφαλεξίνης στη τσιπούρα Sparus aurata,, πραγματοποιήθηκαν πέντε πειράματα στο Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών και στο Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας Κρήτης. Για το προσδιορισμό της τοξικότητας των ουσιών, πραγματοποιήθηκαν αιματολογικές, ορολογικές και ιστολογικές εξετάσεις οι οποίες περιελάμβαναν τη μέτρηση της τιμής του αιματοκρίτη, της αιμοσφαιρίνης, του αριθμού των ερυθρών και λευκών αιμοσφαιρίων, τη διαφοροποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων, τη μέτρηση συγκέντρωσης ηλεκτρολυτών, ουρίας αίματος, αλκαλικής φωσφατάσης, κρεατίνης γλυκόζης, ιστολογικές παρατηρήσεις για πιθανές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις σε ήπαρ, νεφρό, σπλήνα και γαστρεντερικό σωλήνα και μακροσκοπικές παρατηρήσεις που αφορούσαν στη συμπεριφορά των ψαριών κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Για την ανίχνευση της ιβερμεκτίνης στο αίμα και στους ιστούς χρησιμοποιήθηκε ανοσοενζυμική μέθοδος ELISA έπειτα από εκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction) ενώ για την ανίχνευση της κεφαλεξίνης χρησιμοποιήθηκε Υγρη Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC). Με βάση τα αποτελέσματα των πειραμάτων της τοξικότητας και της κινητικής της ιβερμεκτίνης σχεδιάστηκε και πραγματοποιήθηκε πείραμα ελέγχου νευροτοξικότητας της ιβερμεκτίνης στη τσιπούρα με σκοπό τη διερεύνηση της δυνατότητας της ουσίας να διαπεράσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Η τοξικότητα της ιβερμεκτίνης είναι σχετικά χαμηλή και αναστρέψιμη. Οι κυριότερες ενδείξεις τοξικότητας της ουσίας είναι η πτώση της τιμής του αιματοκρίτη, η αύξηση της αιμοσφαιρίνης, η αύξηση του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων, η παρουσία μονοκυττάρων, η αύξηση των λεμφοκυττάρων και η αύξηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης. Η ιβερμεκτίνη όταν βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα των ψαριών δρα αιμολυτικά και προκαλεί τοξικές αντιδράσεις. Επίσης, σε υψηλές συγκεντρώσεις (που υπερβαίνουν έως και 8 φορές την συνήθη δοσολογία χορήγησης), προκαλεί έντονο στρες στα ψάρια που εμφανίζεται με μη φυσιολογική συμπεριφορά όπως απώλεια όρεξης, ληθαργική κολύμβηση και απώλεια προσανατολισμού. Από τον έλεγχο νευροτοξικότητας της ουσίας προέκυψε πως η ιβερμεκτίνη, σε αντίθεση με τις υπάρχουσες αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία, διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και βιοσυσσωρεύεται στον εγκέφαλο. Η συσσώρευση της ουσίας στον εγκέφαλο είναι άμεση, αρχίζει 1 ώρα μετά τη χορήγηση, φθάνει σε ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις και διατηρεί ισορροπία, παρουσιάζοντας κυκλοφορία μεταξύ του εγκεφάλου και του αίματος. Τα σημάδια τοξικότητας φθίνουν με την πάροδο του χρόνου και τα ψάρια επανέρχονται στο φυσιολογικό με το πέρας του πειράματος. Η ιβερμεκτίνη απορροφάται ταχύτατα παρουσιάζοντας μέγιστη συγκέντρωση πάνω από 300 ng ml-1, 2 ώρες μετά τη χορήγηση, έχει υψηλή βιοδιαθεσιμότητα και απομακρύνεται γρήγορα έχοντας ημίσιο χρόνο απομάκρυνσης 15.37 ώρες. Οι υψηλές συγκεντρώσεις της ιβερμεκτίνης κατά τη διάρκεια των 2 πρώτων ωρών επιβεβαιώνουν τις τοξικές αντιδράσεις των ψαριών στην ουσία που παρατηρήθηκαν στα πειράματα ελέγχου τοξικότητας. Η κεφαλεξίνη δεν είναι τοξική για την τσιπούρα ακόμη και σε πολύ υψηλές δόσεις που υπερβαίνουν 20 φορές την συνιστόμενη δόση. Δεν παρατηρήθηκαν τοξικές επιδράσεις του φαρμάκου ούτε σε αιματολογικό-βιοχημικό επίπεδο ούτε στη συμπεριφορά των ψαριών. Η κινητική συμπεριφορά του φαρμάκου στην τσιπούρα είναι ίδια με αυτή που παρατηρήθηκε και σε άλλους οργανισμούς. Η κεφαλεξίνη παρουσιάζει ταχύτατη απορρόφηση, κατανομή και απομάκρυνση. Η μέγιστη συγκέντρωση της ουσίας είναι 5.41 mg ml-1kg-1 , συγκέντρωση που παρατηρήθηκε 1 ώρα μετά τη χορήγηση. Ο χρόνος ημίσιας ζωής της απομάκρυνσης είναι 1.83 ώρες. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν πως τόσο η ιβερμεκτίνη όσο και η κεφαλεξίνη μπορούν να θεωρηθούν ασφαλή φάρμακα για χρήση στις υδατοκαλλιέργειες αρκεί βέβαια να χρησιμοποιούνται σε δοσολογίες που δεν υπερβαίνουν τις συνιστώμενες ειδικότερα για την ιβερμεκτίνη η οποία σε υψηλές δόσεις μπορεί να προκαλέσει νευροτοξικότητα.