Μελέτη της αλληλεπίδρασης συστατικών της χρωματίνης με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη σε σωματικά και σπερματικά κύτταρα

Abstract

Morphological observations suggest a close association between heterochromatin and the nuclear envelope. To investigate the molecular aspects of this association, we initially demonstrated that polynucleosomal particles isolated from avian erythrocytes bind to LBR, an integral protein of the inner nuclear membrane. Binding is mediated by the basic nucleoplasmic N-terminal domain of LBR. A fusion protein containing GST and the N-terminal domain of LBR (GST-wtNt) associates efficiently with the polynucleosomal particles. The arginine/serine-rich (RS) stretch of LBR does not seem to be critical for this association, since a similar fusion protein lacking the RS stretch (GST-ΔRS) also binds efficiently to the polynucleosomal particles. To determine whether LBR associates with histones, we performed pull-down experiments using isolated histones and GST-wtNt. The N-terminal domain of LBR binds preferentially to histones H3 and H4, but not to histones H2A, H2B and H1. To analyze the binding of LBR to histones we constructed a set of GST fusion proteins, each containing a subfragment of the whole N-terminal domain. We then showed that the region encompassed by amino acids 62 to 92 is responsible for the histone binding capacity of LBR. In a following step, we demonstrated that binding of histones H3 and H4 to the N-terminal domain of LBR is mediated by small RNA molecules. Bacterial RNA molecules remained associated with recombinant GST-wtNt during the whole purification procedure. The RNA binding domain of LBR has been mapped to the region between amino acids 62 to 92. All kinds of eukaryotic RNA (total RNA, tRNA, nuclear RNA) were able to associate with GST-wtNt, yet the binding of nuclear RNA persisted even at 750 mM ΚCl. Previous reports claimed association of the same stretch of the N-terminal domain of LBR with double-stranded DNA. However, binding of DNA did not occur under more stringent conditions (e.g. in the presence of high salt concentrations) and therefore may not be physiologically meaningful. GST-wtNt phosphorylation by recombinant SRPK1 or interphase extracts from Hela cells completely abolishes binding of RNA and DNA. During mammalian spermiogenesis, histones are replaced by protamines. Protamines initially appear at the nuclear periphery, implying that the nuclear envelope may play a role in the replacement process. Protamine 1 contains a short argine/serine-rich (RS) domain, that is efficiently phosphorylated by SRPK1. Given that RS domains mediate protein-protein interactions, we sought to investigate the potential interaction of protamine 1 with LBR. Using in vitro binding assays we demonstrated that phosphorylated protamine 1 binds specifically to the RS region of LBR. Moreover, protamine 1 co-immunoprecipitates with LBR from testis nuclear extracts. Previous studies have shown that the cellular protein p32 also binds tightly to the unmodified RS domain and prevents phosphorylation of LBR. In this thesis we reinvestigated the significance of the p32-LBR interaction, presenting evidence that p32 prevents P1 protamine association with LBR. Immunofluorescence microscopy studies on several isolated spermiogenic cells during the elongation process clearly showed that protamine 1 and LBR exhibit the same peripheral, polarized distribution in the nucleus of elongating spermatids. Finally, we made an initial attempt to determine more specifically the serine residues of protamine 1 that mediate its assosiation with LBR, by constructing a set of protamine derivatives in which Ser9, Ser11 and Ser13 were changed to Ala.

Μια σειρά από μορφολογικές παρατηρήσεις καταδεικνύουν την στενή επαφή ενός μεγάλου μέρους της ετεροχρωματίνης με την πυρηνική περιφέρεια. Στην παρούσα εργασία έγινε μια προσπάθεια διασαφήνισης της μοριακής βάσης της αλληλεπίδρασης αυτής. Αρχικά, βρέθηκε ότι ο LBR, μια πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, αλληλεπιδρά με πολυνουκλεοσώματα και η αλληλεπίδραση αυτή επιτυγχάνεται μέσω του αμινο-τελικού του τμήματος. Στη σύνδεση δεν φαίνεται να συμμετέχει η επαναλαμβανόμενη ακολουθία από αργινίνες και σερίνες (RS) του LBR, δεδομένου ότι το ανασυνδυασμένο αμινο-τελικό άκρο που έχει εκφραστεί στα βακτήρια ως πρωτεΐνη σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και από το οποίο έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-ΔRS) συνδέεται στα πολυνουκλεοσώματα με την ίδια ικανότητα όπως και το αγρίου τύπου αμινο-τελικό άκρο (GST-wtNt). Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια να βρεθεί με ποιο συστατικό των νουκλεοσωμάτων αλληλεπιδρά ο LBR. Πειράματα συγκατακρήμνισης έδειξαν ότι το αμινο-τελικό άκρο του LBR συνδέεται εξειδικευμένα με τις ιστόνες Η3 και Η4, ενώ δεν συνδέεται καθόλου με τις Η2Α, Η2Β, καθώς και με την συνδετική ιστόνη Η1. Χρησιμοποιώντας σε πειράματα συγκατακρήμνισης μια σειρά από ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, κάθε μια από τις οποίες περιείχε ένα μικρότερο τμήμα του αμινο-τελικού άκρου, διαπιστώθηκε ότι η περιοχή που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 είναι υπεύθυνη για την δέσμευση των ιστονών Η3 και Η4. Σε ένα επόμενο στάδιο διευκρινίστηκε ότι το αμινο-τελικό τμήμα του LBR κατά την έκφραση του σε βακτηριακά κύτταρα, ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GST, διατηρεί δεσμευμένο πάνω του βακτηριακό RNA. Το βακτηριακό RNA δεσμεύεται στην περιοχή μεταξύ των αμινοξέων 62 έως 92 και φαίνεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην δέσμευση κυρίως της ιστόνης Η3, αλλά και της Η4. Απομάκρυνση του RNA έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της ικανότητας σύνδεσης των δύο ιστονών, ενώ επώαση του τμήματος που περικλείεται από τα αμινοξέα 62 έως 92 με διάφορα είδη ευκαρυωτικού RNA επαναφέρει την ικανότητα δέσμευσης της ιστόνης Η3. Η δέσμευση του ευκαρυωτικού RNA είναι πολύ ισχυρή. Πυρηνικό RNA παραμένει δεσμευμένο ακόμα και σε εξαιρετικά υψηλές τιμές ιονικής ισχύος (750 mM ΚCl). Παλαιότερα, η περιοχή αυτή είχε αναφερθεί ότι δεσμεύει και δίκλωνο DNA Η δέσμευση όμως του DNA επιτυγχάνεται μόνο σε διαλύματα σχετικά χαμηλής ιονικής ισχύος, γεγονός που θέτει σε αμφισβήτηση τη φυσιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης αυτής. Η δέσμευση των νουκλεϊκών οξέων στον LBR παρεμποδίζεται όταν η RS ακολουθία του LBR έχει φωσφορυλιωθεί είτε από την ανασυνδυασμένη κινάση SRPK1 είτε από μεσοφασικό εκχύλισμα HeLa κυττάρων. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε ο ρόλος του LBR στην διαδικασία της σπερμιογένεσης, δηλαδή της παραγωγής ώριμων σπερματοζωαρίων. Κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης οι ιστόνες αντικαθίστανται από τις πρωταμίνες. Η πρωταμίνη 1 περιέχει στο μόριο της μια μικρή RS ακολουθία, οι σερίνες της οποίας αποτελούν υπόστρωμα της SRPK1 κινάσης. Δεδομένου ότι οι RS ακολουθίες είναι υπεύθυνες για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών, ερευνήσαμε την πιθανή αλληλεπίδραση της πρωταμίνης 1 με τον LBR. Στην μελέτη αυτή μας οδήγησε και η παλαιότερη παρατήρηση ότι οι πρωταμίνες πρωτοεμφανίζονται στην περιφέρεια του πυρήνα κατά την διάρκεια της σπερμιογένεσης. Βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση της πρωταμίνης 1 από την SRPK1 έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση της με την RS ακολουθία του αμινο-τελικού τμήματος του LBR. Βρέθηκε επίσης ότι δέσμευση της κυτταρικής πρωτεΐνης p32 (η οποία ήταν γνωστό από παλαιότερες εργασίες ότι αλληλεπιδρούσε με τον LBR) στο αμινο-τελικό άκρο του LBR παρεμπόδιζε την δέσμευση της πρωταμίνης 1. Μελέτες ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι ο LBR και η πρωταμίνη 1 εμφανίζουν την ίδια εντόπιση, στην περιφέρεια του πυρήνα κατά τα αρχικά στάδια της σπερμιογένεσης. Τέλος, με την δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της πρωταμίνης 1, επιδιώχθηκε η συστηματικότερη μελέτη του ρόλου κάθε μιας σερίνης της RS ακολουθίας στην αλληλεπίδραση με τον LBR.