Ενδοκυτταρικοί μηχανισμοί μεταγωγής μηνυμάτων μέσω των συζευγμένων με G πρωτείνες υποδοχέων στην καρδιά αρουραίου

Abstract

In cardiac myocytes, GPCRs (G-protein coupled receptors) are involved in rapid changes in contractility, metabolic responses and electrophysiological properties. Stimulation of GPCR may also lead to long-term maintenance of cardiac function through regulation of gene expression and cell growth. The purpose of this study was to investigate the pathways leading to MAPK activation in response to GPCR agonists and to identify the molecular downstream targets of these kinases in adult rat ventricular myocytes. As a first step, we investigated the activation of MAPKs in response to hypertrophic agonists, such as phenylephrine and endothelin-1. Both agonists induced activation of ERK1/2 and p38 MAPK, whereas JNK1/2 phosphorylation was modest under these conditions. Using selective inhibitors, activation of ERK1/2 was shown to involve MEK1/2, PKC protein tyrosine kinase and PI3K. In contrast, p38 MAPK phosphorylation was not mediated through MEK1/2 or PKC. Mitogen- and stress-activated protein kinase-1 (MSK1) is a new MAPK target protein that is present in various mammalian cell types. MSK1 is activated by a variety of extracellular signals that include growth factors, phorbol esters, and cell damaging stimuli. In the present study, we demonstrate that MSK1 is present in adult rat cardiac myocytes and it is activated in response to hypertrophic GPCR agonists, such as phenylephrine and endothelin. Both agonist induced phosphorylation of MSK1 at Thr581 and Ser376, but not Ser360. Maximal phosphorylation was observed at 10-15 min after stimulation and it correlated with increased activity. Phosphorylation and activation of MSK1 was completely inhibited by either PD98059, or SB203580, suggesting that MSK1 activation by GPCR agonists in adult rat ventricular myocytes requires the simultaneous activation of both p38 MAPK and ERKs pathways. In contrast the PKA inhibitor, RpcAMP, had no effect on MSK1 activation and phosphorylation. MSK1 has been implicated in the regulation of transcriptional activation and one potential substrate is the cAMP responsive element (CRE) binding protein (CREB), a basic leucine zipper (bZip) transcription factor. Several studies suggested CREB as an important regulator of gene expression in cardiomyocytes with possible relevance for the pathophysiology of heart. However, the signaling events involved in the activation of CREB by hypertrophic stimuli have not yet been demonstrated in cardiomyocytes. In the present study, we characterized the phosphorylation of CREB by the hypertrophic G-protein-coupled receptor agonist, PE, in adult rat ventricular myocytes. Based on our reports that MSK1 is activated in response to PE, we used the inhibitors Ro318220 and H89 to determine the role of MSK1 in the activation of

Οι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες υποδοχείς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία της καρδιάς επηρεάζοντας τις συσταλτικές, ηλεκτροφυσιολογικές και μεταβολικές ιδιότητες της και Επιπλέον συμμετέχουν σε διαδικασίες κυτταρικής αύξησης ρυθμίζοντας την έκφραση των γονιδίων. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των σηματοδοτικών που οδηγούν στην ενεργοποίηση των MAPKs από τους αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών-στόχων των κινασών στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Στο πρώτο στάδιο της εργασίας διερευνήθηκε η ενεργοποίηση των MAPKs μετά από τη διέγερση υποδοχέων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της υπερτροφίας της καρδιάς, όπως είναι οι α1-αδρενεργικοί υποδοχείς και οι υποδοχείς της ενδοθηλίνης- 1. Διαπιστώθηκε ότι οι αγωνιστές των συγκεκριμένων υποδοχέων, φαινυλεφρίνη και ενδοθηλίνη-1, επάγουν την ενεργοποίηση των ERK1/2 και p38 MAPK, ενώ δεν αυξάνουν σημαντικά τη φωσφορυλίωση των JNK1/2. Η χρήση αναστολέων διαφόρων κινασών αποκάλυψε ότι η ενεργοποίηση των ERK1/2 στις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες επιτυγχάνεται με τη διαμεσολάβηση των ΜΕΚ1/2, PKC πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης και PI3K. Αντίθετα, η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη και την ενδοθηλίνη-1 φωσφορυλίωση της p38 MAPK εξαρτάται από τη ΡΙ3Κ και τις πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης, ενώ δεν εμπλέκονται οι ΜΕΚ1/2 και η PKC. Η MSK1 είναι μια κινάση που αναγνωρίστηκε πρόσφατα σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και θεωρείται ότι είναι υπόστρωμα των MAPKs. Τα ερεθίσματα που την ενεργοποιούν περιλαμβάνουν αυξητικούς παράγοντες, φορβολεστέρες και διάφορες μορφές κυτταρικού στρες. Στην παρούσα μελέτη αποδείχτηκε ότι η MSK1 εκφράζεται στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου και ότι ενεργοποιείται από τη φαινυλεφρίνη και ενδοθηλίνη. Οι συγκεκριμένοι αγωνιστές επάγουν τη φωσφορυλίωση της κινάσης στα κατάλοιπα Thr581 και Ser376, όχι όμως στη Ser360. Η μέγιστη τιμή της φωσφορυλίωσης της κινάσης εντοπίζεται στα 10-15 λεπτά επώασης με τους αγωνιστές και συνοδεύεται από αύξηση της ενζυμικής της δραστικότητας. Η ενεργοποίηση και η φωσφορυλίωση της MSK1 αναστέλλεται πλήρως από τον SB203580 ή το PD98059, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση της κινάσης στα καρδιακά μυοκύτταρα προϋποθέτει τη συντονισμένη οδό των ERK1/2 και p38 MAPK. Αντίθετα, ο αναστολέας της ΡΚΑ, RpcAMP, δεν επηρέασε την ενεργοποίησητης MSK1. Η MSK1 θεωρείται ότι συμμετέχει στη ρύθμιση της μεταγραφής και ένα πιθανό υπόστρωμα της είναι ο bZip μεταγραφικός παράγοντας CREB. Αρκετές μελέτες