Μακρομοριακή σύσταση υαλοειδούς οφθαλμού θηλαστικών: ειδική αναφορά στις συζεύξιμες πρωτεογλυκάνες και τη δομή των γλυκοζαμινογλακανών

Abstract

The vitreous of all species is composed of essentially the same type of extracellular matrix macromolecules organized to a transparent gel. The aim of this study was 1) to examine the macromolecular composition of pig vitreous gel and particularly of hyaluronan-interacting proteoglycans, 2) to determine the composition and fine chemical structure of the glycosaminoglycans (GAGs) in the vitreous gel from sheep and goat and to compare with those from human and pig vitreous gels. The first study showed that the whole pig vitreous gel contain 76 μg of hyaluronan-derived uronic acid, 700 μg of total protein and 150 μg of collagen per ml of gel. The contents of neutral hexoses and sialic acids were 80 and 22 μg/ml of vitreous gel, but only a minor proportion of them were found to be associated with the proteoglycan fraction. As estimated by gel chromatography on Sepharose CL-2B, hyaluronan presents a polydisperse hydrodynamic behaviour with a lower molecular mass (Mr) value of 220 kDa. The existence of low amounts of hyaluronan-binding proteoglycan population with structural and immunological characteristics similar to a member of the hyalectan family, versican, has also been demonstrated. The concentration of this versican-like proteoglycan in whole vitreous accounts for 50 μg proteoglycan protein per ml of vitreous gel and represents a minor proportion (ca 7%) of the total protein content. The proteoglycan has an average Mr of 360 kDa and is substituted by chondroitin sulphate (CS) side chains. Study of the CS sulphation pattern showed that the chains were composed of both type of 4- and 6-sulphated disaccharide units. The results from the second part of the study showed that, in all examined species; hyaluronan was the predominant GAG, whereas chondroitin sulphate was the minor one. In the vitreous gel of the most relative species, i.e. sheep and goat, higher amounts of both of HA and CS were estimated as compared to pig and human tissues. The distribution of hydrodynamic sizes of HA and CS was significantly differed among different species. All HA preparations were consisted of molecules with great variability in hydrodynamic sizes. The relative proportions of the large sized HA molecules (size >1.8 x 106 kDa) were significantly higher in sheep and goat as compared to human and pig vitreous gel. The length of CS chains was also of larger size in sheep and goat (50 kDa and 58 kDa, respectively) than the respective chains in human and pig vitreous gel (38 kDa and 28 kDa, respectively). The sulphation patterns of CS preparations were determined following enzymic treatments, HPLC and capillary electrophoretic analyses. The human vitreous-derived CS chains showed quite different sulphation profile than that of CS isolated from other species, since 4-sulphated disaccharides were identified as the dominant moiety. In conclusion, significant compositional and structural variations between the vitreous matrixes of different species at the GAG level were identified. The functional significance of these species-dependent variations is discussed.

Το υαλοειδές όλων των οργανισμών αποτελείται από τον ίδιο τύπο μακρομορίων του εξωκυττάριου χώρου, οργανωμένα σε ένα διαυγές πήκτωμα. Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν η λεπτομερής διερεύνηση της σύστασης των μακρομορίων του υαλοειδούς με ιδιαίτερη έμφαση στις πρωτεογλυκάνες από ιστό χοίρων που αλληλεπιδρούν με το υαλουρονικό, καθώς και της σύστασης και της δομής των γλυκοζαμινογλυκανών από υαλοειδές αμνών και αιγών και η σύγκρισή της με αυτή από υαλοειδές ανθρώπου και χοίρου. Το πρώτο μέρος της μελέτης έδειξε τα εξής : Το όλο υαλοειδές περιέχει 76 μg ουρονικών οξέων που προέρχονται από το υαλουρονικό, 700 μg ολικής πρωτεΐνης και 150 μg κολλαγόνου ανά ml υαλοειδούς. Τα αποτελέσματα σε ουδέτερες εξόζες και σιαλικά οξέα ήταν 80 και 22 μg/ml υαλοειδούς, αλλά μόνο ένα μικρό μέρος αυτών βρέθηκε να σχετίζεται με τα κλάσματα των πρωτεογλυκανών. Όπως εκτιμήθηκε από χρωματογραφία πηκτής σε στήλη Sepharose CL-2B, το υαλουρονικό εμφανίζει πολυδιάσπαρτη υδροδυναμική συμπεριφορά με ελάχιστη μοριακή μάζα 220 kDa. Περιγράφεται επίσης η παρουσία χαμηλών ποσών ενός πληθυσμού πρωτεογλυκανών που αλληλεπιδρούν με το υαλουρονικό οξύ, με δομικά και ανοσολογικά χαρακτηριστικά όμοια με ένα μέλος της οικογένειας των υαλεκτανών, τη βερσικάνη. Η συγκέντρωση της πρωτεογλυκάνης αυτής στο ολικό υαλοειδές υπολογίστηκε σε 50 μg πρωτεΐνης ανά ml υαλοειδούς και αντιπροσωπεύει μικρό μέρος (~ 7%) του συνολικού ποσού της πρωτεΐνης. Η πρωτεογλυκάνη έχει μέσο Mr περίπου 360 kDa και πλευρικές αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης (CS). Μελέτη της θείωσης της CS έδειξε ότι οι αλυσίδες αποτελούνται από 4- και 6-θειωμένες υπομονάδες. Το δεύτερο μέρος της μελέτης που αφορούσε τις γλυκοζαμινογλυκάνες έδειξε τα εξής : Σε όλα τα εξεταζόμενα είδη ιστών το υαλουρονικό (ΗΑ) ήταν η κύρια GAG, ενώ η ποσότητα της θειικής χονδροϊτίνης (CS) ήταν δευτερεύουσα. Στο υαλοειδές των περισσότερων συγγενικών ειδών, π.χ. αμνοί και αίγες, βρέθηκαν υψηλότερα ποσά ΗΑ και CS σε σύγκριση με τους ιστούς από χοίρους και ανθρώπους. Η κατανομή των υδροδυναμικών μεγεθών των ΗΑ και CS ήταν διαφορετική μεταξύ των διαφορετικών ειδών. Όλα τα παρασκευάσματα του ΗΑ αποτελούνταν από μόρια με μεγάλη ποικιλομορφία στα υδροδυναμικά τους μεγέθη. Ο σχετικός λόγος του μεγάλου σε μέγεθος μορίου, του υαλουρονικού (Μr > 1.8 x 106 kDa) ήταν σημαντικά υψηλότερος στα υαλοειδή των αμνών και των αιγών σε σύγκριση με τα εκείνα των χοίρων και των ανθρώπων. Το μέγεθος των αλυσίδων των CS ήταν επίσης μεγαλύτερο στα υαλοειδή αμνών και αιγών (50 kDa και 58 kDa, αντίστοιχα) από τις αντίστοιχες αλυσίδες στα υαλοειδή χοίρων και ανθρώπων (38 kDa και 28 kDa αντίστοιχα). Οι εικόνες θείωσης των αλυσίδων CS προσδιορίσθηκαν ακολουθώντας ενζυμικές κατεργασίες, HPLC και ανάλυση με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Οι αλυσίδες CS του υαλοειδούς από άνθρωπο έδειξαν διαφορετική εικόνα θείωσης από εκείνες που απομονώθηκαν από άλλα είδη, αφού οι 6-θειωμένοι δισακχαρίτες αναγνωρίστηκαν ως το κυρίαρχο μέρος της αλυσίδας CS. Συμπερασματικά, αναγνωρίστηκαν σημαντικές διαφορές στη σύνθεση και δομή των επιπέδων των GAGs ανάμεσα στα υαλοειδή διαφορετικών ειδών. Σημειώνεται ότι οι εξαρτώμενες από το είδος μεταβολές στις GAGs και στις συζεύξιμες πρωτεογλυκάνες συσχετίζονται με τη λειτουργική σημασία τους.