Απομόνωση μικροδορυφόρων στη μεσογειακή μύγα Ceratitis Capitata και η χρησιμοποίηση τους στη φυσική και γενετική χαρτογράφηση του γονιδιώματος του εντόμου

Abstract

The aim of this study was the isolation of microsatellites from the genome of the Mediterranean fruit fly and their use in genetic and physical mapping experiments. The isolation was performed by screening genomic libraries constructed for this purpose with probes synthetic oligonucleotides 30 bp long with specific sequence. From 6 different screenings a total of 131 microsatellite containing clones were isolated, which contained 223 different microsatellite repeats. Their majority was dinucleotide repeats and especially TG repeats (47%) showing that this specific motif is ubiquitous in the genome of the Medfly. The physical mapping of the microsatellite clones to the polytene chromosomes of the Medfly was performed with fluorescence in situ hybridization. From these experiments 49 clones showed a unique position to the genome of C. capitata and thus were mapped to the autosomes, 31 comes showed multiple hybridization signals, while 31 did not show a clear hybridization signal. The distribution of the 49 microsatellite clones which were physically mapped was neither analogous to the size of the chromosomes nor uniform throughout the chromosome. In particular, the majority of the microsatellite clones was mapped to chromosomes 4 and 5, which are not the biggest, while to chromosomes 2, 3 and 6 were mapped 5, 3 and 8 microsatellite clones respectively. The non random distribution could be correlated with the uneven distribution of the whole genome to the libraries that were constructed or indeed could reflect their non random distribution to the genome of the insect. The next step was the genetic mapping of the microsatellites through the appropriate crosses and the genotyping of the offspring of the F2 generation. First, were genetically mapped microsatellites which had been previously mapped physically in relation to morphological traits for the 4 out of 5 autosomes. After that, all microsatellites isolated were used and the analysis of the results was performed with the programme JoinMap 3.0. From this analysis 16 different segments were constructed which deputize parts of the genetic map and correspond to different chromosomal locations of the insect. This number is significantly higher than the linkage groups that this insect has. From the 69 microsatellite loci used, only 34 were integrated to the genetic maps. This fact could be a result of the big genome of the Medfly as well as the limited number of microsatellite loci that were used. From the physical mapping experiments clone Dip16b was found in the pericentromeric regions of all the chromosomes except the sixth and the chromosome X. This clone is a minisatellite clone with 44 bp long repeats of the same direction. This sequence is organized in bigger repeats with more than 10.000 bp long. We found that sequences that were close to those repeats showed similarity with transposable genetic elements. Finally, we showed that this pericentromeric sequence is found exclusively in Medfly, thus being absent from closely related species. This sequence is therefore a precious diagnostic molecular tool for distinguishing individuals of this species from individuals of closely related species.

Στόχος της διατριβής αυτής ήταν η απομόνωση μικροδορυφόρων από το γονιδίωμα της Μεσογειακής μύγας και η χρησιμοποίησή τους σε πειράματα γενετικής και φυσικής χαρτογράφησης. Η απομόνωση έγινε με διαλογή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών που κατασκευάστηκαν για το σκοπό αυτό με ανιχνευτές 30μερή συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια συγκεκριμένων αλληλουχιών. Από 6 διαφορετικά πειράματα διαλογής απομονώθηκαν συνολικά 131 μικροδορυφορικοί κλώνοι οι οποίοι περιείχαν 223 διακριτές μικροδορυφορικές αλληλουχίες. Η πλειοψηφία αυτών ήταν δινουκλεοτιδικές και ειδικότερα TG επαναλήψεις (47%), δείχνοντας ότι το συγκεκριμένο μοτίβο βρίσκεται σε αφθονία στο γονιδίωμα της Μεσογειακής μύγας. Μέσω πειραμάτων φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης έγινε φυσική χαρτογράφηση των μικροδορυφορικών κλώνων στα πολυταινικά χρωμοσώματα του εντόμου. Από τα πειράματα αυτά 49 κλώνοι έδωσαν μοναδική θέση στο γονιδίωμα της C. capitata και χαρτογραφήθηκαν στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα, 31 κλώνοι έδωσαν πολλαπλά σήματα υβριδοποίησης, ενώ 31 δεν έδωσαν κάποιο εμφανές σήμα υβριδοποίησης. Η κατανομή των 49 μικροδορυφορικών κλώνων που χαρτογραφήθηκαν κυτταρολογικά δεν ήταν ούτε ανάλογη του μεγέθους των χρωμοσωμάτων ούτε ομοιόμορφη καθόλο το μήκος τους. Ειδικότερα, ο μεγαλύτερος αριθμός μικροδορυφορικών κλώνων και συγκεκριμένα τα 2/3 αυτών χαρτογραφήθηκε στα χρωμοσώματα 4 και 5, τα οποία δεν έχουν και το μεγαλύτερο μέγεθος, ενώ στο 2ο, 3ο και 6ο χρωμόσωμα χαρτογραφήθηκαν 5, 3 και 8 μικροδορυφορικοί κλώνοι αντίστοιχα. Η μη ομοιόμορφη κατανομή μπορεί να σχετίζεται είτε με τη μη αντιπροσώπευση όλων των χρωμοσωματικών περιοχών στις βιβλιοθήκες είτε πράγματι να αντανακλά τη μη τυχαία κατανομή τους στο γονιδίωμα του εντόμου. Το επόμενο βήμα ήταν η γενετική χαρτογράφηση των μικροδορυφόρων μέσω κατάλληλων διασταυρώσεων και γενοτυπικό έλεγχο των ατόμων της F2 γενιάς. Έγινε λοιπόν γενετική χαρτογράφηση των μικροδορυφόρων που είχαν μοναδική θέση στο φυσικό χάρτη σε σχέση με μορφολογικούς δείκτες για τα 4 από τα 5 αυτόσωματα. Σε δεύτερη φάση χρησιμοποιήθηκαν όλοι οι μικροδορυφόροι που απομονώθηκαν, ενώ η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος JoinMap® 3.0. Από την ανάλυση προέκυψαν 16 διαφορετικά τμήματα που αντιπροσωπεύουν περιοχές του γενετικού χάρτη και αντιστοιχούν σε διάφορες χρωμοσωματικές περιοχές του εντόμου, αριθμός σημαντικά μεγαλύτερος από τον αριθμό των ομάδων σύνδεσης. Από τους 69 μικροδορυφορικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν στη γενετική ανάλυση μόνο οι 34 ενσωματώθηκαν στους γενετικούς χάρτες. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο μεγάλο μέγεθος του γονιδιώματος της Μεσογειακής μύγας σε συνδυασμό με τον περιορισμένο αριθμό μικροδορυφορικών δεικτών που εξετάστηκαν. Από τα πειράματα της φυσικής χαρτογράφησης ο κλώνος Dip16b φάνηκε να εντοπίζεται στις περικεντρομερικές περιοχές όλων των χρωμοσωμάτων του εντόμου εκτός του 6ου και του Υ χρωμοσώματος. Ο κλώνος αυτός είναι ένας μινιδορυφορικός κλώνος με ομόρροπες επαναλήψεις μιας αλληλουχίας 44 βάσεων. Η αλληλουχία αυτή οργανώνονται σε μεγάλες επαναλήψεις που ξεπερνούν σε μέγεθος τις 10.000 βάσεις και βρέθηκε ότι αλληλουχίες γειτονικές προς το συγκεκριμένο επαναλαμβανόμενο μοτίβο παρουσιάζουν ομοιότητα με μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία. Τέλος δείξαμε ότι η περικεντρομερική αυτή αλληλουχία εντοπίζεται αποκλειστικά στη Μεσογειακή μύγα, ενώ απουσιάζει ακόμη και από στενά συγγενικά είδη, αποτελώντας έτσι ένα πολύτιμο διαγνωστικό μοριακό εργαλείο για το διαχωρισμό των ατόμων αυτού του είδους από άτομα συγγενικών ειδών.