Η ακτίνη και άλλα αντιγόνα του κυτταρικού σκελετού ως στόχοι φυσιολογικών και παθολογικών αυτοαντισωμάτων: Μελέτη σε ηπατικά νοσήματα και στη βαριά μυασθένεια

Abstract

Actin is one of the main constituents of the cytoskeleton found in all eukaryote cells and also arepresentative autoantigen, as a significantly high proportion of natural autoantibodies (NAbs)possess anti-actin activity. NAbs are found in all healthy individuals and are usually polyspecific. The earliest question raised since the discovery and isolation of NAbs has been their relationship with disease-associated autoantibodies (DAbs), which is of great importance for the understanding of the pathogenesis of autoimmune diseases. The main hypothesis, based on idiotypic and VHJHDH or VLJL gene similarities occurring between DAbs and NAbs, is that DAbs and their respective B-cell clones arise out of a population of B-lymphocytes originally committed to produce NAbs. The production of DAbs during disease may result from either of the following mechanisms: a) polyclonal activation of B-lymphocytes primarily producing NAbs; in this case, DAbs are polyspecific, like NAbs, b) specific antigen selection of Β lymphocytes primarily producing NAbs; in this case, some of the characteristics of DAbs are differentiated from those of NAbs (e.g. DAbs become monospecific, their fine specificity and/or isotype change, somatic mutations are accumulated on their CDR3 sequences). In addition, induced antibodies have also been correlated with NAbs; it has been proposed that antibodies induced after immunization with the autoantigen, derive from the same B-cell clones which primarily produce NAbs, but under the antigen pressure, they are differentiated (as compared to NAbs) through the accumulation of somatic mutations on their V genes. Based on actin being a representative self-antigen, the aims of this study were: 1) To investigate the relationship between natural anti-actin antibodies (N-AAA) (from sera of healthy donors) and disease associated AAA (D-AAA) from patients with autoimmune hepatitis type 1 (AIH-1) 2) To investigate the relationship between N-AAA (from sera before immunization) and induced AAA (produced after immunization of rabbits with actin). For this purpose, we compared the immunological properties: a) polyspecificity, b) fine specificity (recognized epitopes of actin) and c) isotype (IgG class and IgG subclasses), between the three populations of AAA (N-AAA, D-AAA and induced), which are isolated on actin immunoadsorbent from the respective sera and antisera. During the first part of this study, IgG AAA were isolated from patients with AIH-1 (AAA are considered as a marker AIH-1 and are associated with a more severe outcome of this disease). AAA were also isolated from two other control groups, an autoimmune liver disease, primary biliary cirrhosis (PBC) and an non-liver autoimmune disease, myasthenia gravis (MG). AAA have also been detected in the above diseases, but less frequently and in lower titer than in AIH-1. Polyspecificity was studied by ELISA based on actin and other cytoskeleton (myosin, tropomyosin, desmin and tubulin) and non-cytoskeleton antigens (thyroglobulin). Fine specificity was primarily studied by Western blotting using proteolytic fragments of actin (produced after its digestion by Staphylococcus aureus V8 protease) and subsequently by ELISA against 12-peptides of actin (which cover the whole actin sequence). The concentration of AAA of different IgG subclasses was measured using a quantitative ELISA. Results from the comparison between N-AAA and D-AAA revealed both similarities and differences. a) Both N-AAA and D-AAA are polyspecific, reacting with the autologous antigen (actin) and several heterologous antigens. b) AAA from all disease groups and healthy controls, recognize common epitopes on actin molecule, contained in the 35 kDa fragment of actin (which comprises a great part of actin sequence, at least to 337aa). However, AAA from the two autoimmune liver diseases are differentiated from NAbs and AAA from MG, as they specifically react against epitopes contained in the fragment of 16 kDa (229-377aa) and peptide P36 (351-362aa). No difference in fine specificity was found between AAA from AIH-1 and PBC. c) AAA from all disease groups and healthy controls, contain all four IgG subclasses.Nevertheless, IgGl and IgG3 are specifically increased in AAA from AIH-1 and PBC, respectively, as compared to N-AAA and AAA from MG. These are the two subclasses activating the complement and having a potential role in pathogenesis. No difference was noticed between N-AAA and AAA from MG. In the second part of this study, N-AAA were isolated on actin immunoadsorbent from the preimmune sera and induced AAA were isolated from the antisera of the primary (first immunization) and secondary immune response (immunization stage representing the highest response). Subsequently, the immunological properties of N-AAA and induced AAA were compared, using the same methodology as for D-AAA. Results showed that induced AAA which are produced during the secondary immune response, are differentiated under the antigen pressure, from N-AAA and AAA of the primary immune response: they become monospecific with different fine specificity, as they react against additional epitopes contained in the central sequence of actin. In addition, induced AAA have different characteristics as compared to DAAA from AIH-1 and PBC, as the former do not recognize the proteolytic fragment of 16 kDa or peptide P36. The above result suggests that the antigenic stimulus during the course of the disease differs from that used during the immunization process (e.g. actin modified by viral antigens). Finally, using new and sensitive immunological methods, developed during this study and having available the specific material (patients' sera and normal sera), we were able to make some clinical correlations between AIH-1 and other liver diseases, autoimmune (like PBC) and non-autoimmune (like viral hepatitis Β and C). Using the routine diagnostic tests, serological similarities are frequently found between AIH-1 and the other liver diseases. Consequently, the aim of these clinical correlations was to identify a specific immunological marker, in order to clearly diversify AIH-1 from the other liver diseases and improve its diagnosis. For this purpose, we analyzed the antigenic targets of autoantibodies from the above-mentioned diseases and we compared the diagnostic value of classical indirect immunofluorescence (IFL) on tissue sections (which detects anti-smooth muscle antibodies-ASMA, frequently correlated with anti-cytoskeleton antibodies-ACTA) with that of the following tests (which detect ACTA): 1) ELISA based on purified cytoskeleton antigens (actin, myosin, tropomyosin, troponin, vimentin, keratin and desmin), 2) ELISA based on HEp-2 cytoplasmic extract which contains several cytoskeleton proteins (HEp-2 is a carcinoma epithelial cell line from human larynx, frequently used in IFL for the detection of ACTA) and 3) Western blotting on HEp-2 cytoplasmic extract. Results showed that only IFL and ASMA are able to differentiate AIH-1 from the other two liver diseases. However, using the sensitive methods of ELISA and Western blotting, we were able to detect AAA and ACTA, in all liver diseases and thus showed that the immunological overlapping between AIH-1 and PBC is greater than initially found when detecting other groups of autoantibodies (ASMA or anti-mitochondrial antibodies/AMA). To conclude, AAA occurring in autoimmune liver diseases consist of at least two populations: one which shares common characteristics (polyspecificity, fine specificity and subclasses) with N-AAA and another which is differentiated in both fine specificity and subclasses from NAAA. The same was observed for induced AAA, which during the immunization process are differentiated from N-AAA (they become monospecific with different fine specificity). For the first time the epitopes of autoantibodies and induced antibodies against actin were mapped and an epitope, contained in the C-terminus of actin (351-362aa) and specific only for AAA from AIH-1 and PBC, was recognized. On the contrary, induced AAA recognize epitopes which are contained in the N-terminal and central sequence of actin. The two liver diseases were not differentiated, neither on terms of AAA fine specificity nor on terms of AAA titer. Future studies focusing on the immunogenicity of the P36 peptide in experimental animals or the cross-reactivity between anti-P36 AAA and liver-specific antigens, could explain their role in pathogenesis and their relationship with a severe outcome of AIH-1.

Η ακτίνη είναι βασικό δομικό και λειτουργικό συστατικό του κυτταρικού σκελετού όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων και σημαντικό αυτοαντιγόνο, καθώς ένα μεγάλο ποσοστό των φυσικών αυτοαντισωμάτων (ΦΑΑ) παρουσιάζει δραστικότητα έναντι αυτής. Τα ΦΑΑ ανιχνεύονται σε όλα τα υγιή άτομα και είναι συνήθως πολυειδικά. Η διαλεύκανση της σχέσης μεταξύ φυσικών και παθολογικών αυτοαντισωμάτων είναι σημαντική για την κατανόηση, μεταξύ άλλων, του μηχανισμού παθογένεσης μίας αυτοάνοσης κατάστασης και έχει απασχολήσει πολλούς επιστήμονες τα τελευταία χρόνια. Σύμφωνα με την επικρατούσα αντίληψη, τα αυτοαντισώματα στη νόσο προέρχονται από τους ίδιους Β-κλώνους που παράγουν κάτω από φυσιολογικές συνθήκες τα ΦΑΑ. Η υπόθεση αυτή έχει βασιστεί σε ομοιότητες, τόσο σε γονιδιακό επίπεδο, όσο και σε ανοσολογικό (π.χ. ιδιότυποι, ειδικότητα), που έχουν βρεθεί μεταξύ των αυτοαντισωμάτων στην υγιή και παθολογική κατάσταση.Θεωρείται έτσι, ότι τα αυτοαντισώματα στη νόσο παράγονται, είτε ως αποτέλεσμα πολυκλωνικής διέγερσης των φυσικών Β-κλώνων και είναι πολυειδικά, όπως τα ΦΑΑ, είτε ως αποτέλεσμα δευτερογενούς απόκρισης στο αντιγόνο και συσσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων στα Β-κύτταρα, με αποτέλεσμα να εξειδικεύονται για το αντιγόνο (μονοειδικά, με διαφορετική επιμέρους εξειδίκευση και ισότοπο). Παράλληλα με τη συσχέτιση φυσικών και παθολογικών αυτοαντισωμάτων, τα φυσικά έχουν συσχετιστεί και με τα επαγόμενα αντισώματα. Πιστεύεται δηλαδή ότι και αυτά προέρχονται από τους ίδιους Β-κλώνους που παράγουν τα ΦΑΑ, έχουν όμως διαφοροποιηθεί από αυτά, με τη συσσώρευση σημειακών μεταλλάξεων κάτω από την "πίεση" από το αντιγόνο ανοσοποίησης. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας ένα κύριο αντιγόνο του εαυτού, όπως η ακτίνη, θέσαμε δύο κύριους στόχους: 1) Τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ των φυσικών αντι-ακτίνης αντισωμάτων (Φ-ΑΑΑ) και των AAA στην αυτοάνοση ηπατίτιδα τύπου-1 (ΑΗ-1). 2) Τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ των φυσικών (προ-ανοσοποίησης) και των επαγόμενων AAA, που παράγονται έπειτα από υπερανοσοποίηση πειραματόζωων με ακτίνη. Για την επίτευξη αυτών των στόχων συγκρίθηκαν οι ανοσολογικές ιδιότητες α) πολυειδικότητα, β) επιμέρους εξειδίκευση και γ) ισότυπος (τάξεις, υποτάξεις), μεταξύ των τριών πληθυσμών AAA (Φ-ΑΑΑ, παθολογικών και επαγόμενων), οι οποίοι απομονώνονται σε ανοσοπροσροφητή ακτίνης από τους αντίστοιχους ορούς και αντιορούς. Για το πρώτο σκέλος της μελέτης, απομονώνονται AAA τάξης IgG από ορούς υγιών ατόμων και ορούς ασθενών με ΑΗ-1 (τα AAA θεωρούνται ορολογικός δείκτης της ΑΗ-1 και έχουν συνδεθεί με τη σοβαρότητα της νόσου). Χρησιμοποιήθηκαν επίσης και οροί από άλλα δύο αυτοάνοσα νοσήματα ελέγχου, ένα ηπατικό την πρωτοπαθή χολική κίρρωση (ΠΧΚ) και ένα μη ηπατικό, τη βαριά μυασθένεια (ΒΜ), στα οποία επίσης ανιχνεύονται AAA, σε μικρότερη όμως συχνότητα και τίτλο σε σχέση με την ΑΗ-1. Η πολυειδικότητα των AAA ελέγχθηκε σε ELISA έναντι κυτταροσκελετικών (ακτίνη, μυοσίνη, τροπομυοσίνη, δεσμίνη και τουμπουλίνη) και μη κυτταροσκελετικών αντιγόνων (θυρεοσφαιρίνη). Η μελέτη της επιμέρους εξειδίκευσης πραγματοποιήθηκε σε ανοσοαποτύπωση με ακινητοποιημένα πρωτεολυτικά θραύσματα της ακτίνης (από την πέψη της με S. aureus V8 πρωτεάση) και σε ELISA με ακινητοποιημένα συνθετικά 12-πεπτίδια της ακτίνης (που καλύπτουν όλη την αλληλουχία της και επικαλύπτονται μεταξύ τους ανά δύο αμινοξέα). Τέλος η μέτρηση της συγκέντρωσης των υποτάξεων των IgG AAA, έγινε με ειδική ELISA. Τα αποτελέσματα από τη σύγκριση των παραπάνω ιδιοτήτων των απομονωμένων φυσικών και παθολογικών AAA, αποκάλυψαν σημαντικές ομοιότητες αλλά και διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αυτοαντισωμάτων. Πιο συγκεκριμένα βρέθηκε: α) Τα AAA ανεξάρτητα από την προέλευση τους είναι πολυειδικά, αντιδρούν δηλαδή όπως και τα Φ-AAA, με το αυτόλογο και διάφορα ετερόλογα αντιγόνα, β) Τα AAA από όλα τα νοσήματα και τους υγιείς μάρτυρες, αναγνωρίζουν κοινούς επιτόπους στο μόριο της ακτίνης, οι οποίοι εντοπίζονται στην περιοχή του θραύσματος των 35 kDa (περιλαμβάνει ένα μεγάλο μέρος της αλληλουχίας της ακτίνης τουλάχιστον μέχρι το 337αα). Ωστόσο, τα AAA από τα δύο αυτοάνοσα ηπατικά νοσήματα διαφοροποιούνται από τα Φ-ΑΑΑ και τα AAA από ΒΜ, καθώς μόνο αυτά αναγνωρίζουν επιτόπους που βρίσκονται στο θραύσμα των 16 kDa (229-377αα) και στο πεπτίδιο Ρ36 (351-362αα). Τα AAA από την ΑΗ-1 και την ΠΧΚ δεν διαφοροποιούνται μεταξύ τους.γ) Σε όλα τα AAA ανιχνεύονται και οι τέσσερις IgG υποτάξεις. Ωστόσο, τα AAA από τα αυτοάνοσα ηπατικά νοσήματα διαφοροποιούνται σε σχέση με τα Φ-ΑΑΑ, καθώς παρουσιάζουν αυξημένες τις IgGl και IgG3 υποτάξεις που δεσμεύουν το συμπλήρωμα και συσχετίζονται καλύτερα με παθογενετικούς μηχανισμούς. Καμία διαφοροποίηση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των Φ-ΑΑΑ και AAA από ΒΜ. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης, τα Φ-ΑΑΑ απομονώθηκαν σε ανοσοπροσροφητήακτίνης από ορούς του προ-ανοσοποίησης σταδίου, ενώ τα επαγόμενα AAA από αντιορούς τηςπρωτογενούς (στάδιο 1ης ανοσοποίησης) και δευτερογενούς ανοσολογικής απόκρισης (στάδιομέγιστης απόκρισης). Στη συνέχεια, οι ιδιότητες των Φ-ΑΑΑ και επαγόμενων αντισωμάτων μελετήθηκαν με την ίδια μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε και για τα AAA από τη νόσο. Τααποτελέσματα έδειξαν ότι επαγόμενα αντισώματα της δευτερογενούς ανοσολογικής απόκρισηςδιαφοροποιούνται κάτω από την "πίεση" του αντιγόνου, από τα Φ-AAA και τα AAA της πρωτογενούς ανοσολογικής απόκρισης. Είναι μονοειδικά και έχουν διαφορετική επιμέρους εξειδίκευση, αναγνωρίζουν δηλαδή επιπλέον επκόπους της κεντρικής περιοχής της ακτίνης. Ωστόσο, τα επαγόμενα AAA έχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και σε σχέση με τα AAA από τη νόσο, καθώς δεν αναγνωρίζουν το καρβοξυτελικό V8 θραύσμα των 16 kDa και το πεπτίδιο Ρ36, υποδηλώνοντας έτσι ότι στη νόσο, το ανπγονικό ερέθισμα για την παραγωγή των AAA διαφέρει από αυτό της υπερανοσοποίησης (π.χ. ακτίνη πιθανά τροποποιημένη από ιϊκά αντιγόνα). Τέλος, έχοντας αναπτύξει ευαίσθητες μεθόδους (ELISA και ανοσοαποτύπωση) και διαθέτοντας το απαραίτητο υλικό (οροί ασθενών και υγιών μαρτύρων), πραγματοποιήθηκαν κλινικές συσχετίσεις ανάμεσα στην ΑΗ-1 και άλλα ηπατικά νοσήματα, αυτοάνοσα (ΠΧΚ) και μη αυτοάνοσα (ιογενείς ηπατίτιδες Β και C), με τα οποία η ΑΗ-1 παρουσιάζει συχνά ορολογικές επικαλύψεις (με βάση τη διαγνωστική μέθοδο ρουτίνας). Στόχος ήταν επομένως, η αναγνώριση ενός ειδικού ανοσολογικού δείκτη που θα μπορούσε να διευκολύνει τη διάγνωση καινά συμβάλλει στη σαφή ορολογική διάκριση της ΑΗ-1 από τα υπόλοιπα ηπατικά νοσήματα της μελέτης. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν οι αντιγονικοί στόχοι των αυτοαντισωμάτων από τα παραπάνω νοσήματα και συγκρίθηκε η διαγνωστική αξία της μεθόδου ρουτίνας του IFL σε τομές ιστού (ανιχνεύει αντισώματα έναντι λείου μυός-ASMA, τα οποία έχουν συσχετιστεί με τα αντικυτταροσκελετικά αντισώματα-ACTA), με τις μεθόδους που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο και ανιχνεύουν ACTA: 1) ELISA με καθαρά κυτταροσκελετικά αντιγόνα (ακτίνη, μυοσίνη, τροπομυοσίνη, τροπονίνη, βιμεντίνη, κεράτινη, δεσμίνη) 2) ELISA με ΗΕp-2 κυτταροπλασματικό εκχύλισμα, το οποίο περιέχει μίγμα κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών (ΗΕp2: σειρά ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων λάρυγγα που έχουν χρησιμοποιηθεί στον IFL για την ανίχνευση ACTA) 3) ανοσοαποτύπωση σε ΗΕp-2 κυτταροπλασματικό εκχύλισμα. Τα αποτελέσματα της παραπάνω συγκριτικής μελέτης έδειξαν ότι μόνο ο IFL και τα ASMA μπορούν να διαχωρίσουν την ΑΗ-1 από τα άλλα δύο ηπατικά νοσήματα. Ωστόσο, οι ευαίσθητες μέθοδοι της ELISA και ανοσοαποτύπωσης, έδοσαν τη δυνατότητα να ανιχνευθούν τα AAA και τα ACTA γενικότερα, σε όλα τα ηπατικά νοσήματα και έδειξαν ότι ανοσολογικά, η ΑΗ-1 και ΠΧΚ επικαλύπτονται σε μεγαλύτερο ποσοστό από αυτό που έχει αναφερθεί χρησιμοποιώντας άλλες κατηγορίες αντισωμάτων (ASMA ή αντι-μιτοχονδριακά αντισώματα/ΑΜΑ). Συμπερασματικά, στη μελέτη αυτή χρησιμοποιώντας ως εργαλεία τα αυτοαντισώματα έναντι ακτίνης, δείξαμε την ύπαρξη τουλάχιστον δύο πληθυσμών αυτοαντισωμάτων στα αυτοάνοσα ηπατικά νοσήματα, ενός ίδιου με τα φυσικά (πολυειδικά AAA με παρόμοια επιμέρους εξειδίκευση και υποτάξεις) και ενός που κάτω από την πίεση του αντιγόνουδιαφοροποιείται σε σχέση με τους φυσικούς του προγόνους (AAA με διαφορετικό επίτοπο καιυπόταξη). Ανάλογα, τα επαγόμενα AAA διαφοροποιούνται κατά την εξέλιξη των ανοσοποιήσεων με ακτίνη, σε μονοειδικά, με διαφορετική επιμέρους εξειδίκευση. Για πρώτη φορά χαρτογραφήθηκαν οι επίτοποι των αυτοαντισωμάτων έναντι ακτίνης και αναγνωρίστηκε επίτοπος στο καρβοξυτελικό άκρο της ακτίνης (351-362αα), ειδικός μόνο για τα AAA από την ΑΗ-1 και την ΠΧΚ. Αντίθετα, οι επίτοποι των επαγόμενων AAA εντοπίζονται στην αμινοτελική και κεντρική περιοχή της ακτίνης. Τα δύο αυτοάνοσα νοσήματα δεν διαφοροποιούνται μεταξύ τους, ούτε με βάση την εξειδίκευση ούτε με βάση τον τίτλο των AAA. Στο μέλλον, η μελέτη της ανοσογονικότητας του πεπτιδίου Ρ36 σε πειραματικά μοντέλα καθώς και η διερεύνηση της ύπαρξης διασταυρούμενης αντίδρασης μεταξύ των αντι-Ρ36 και ηπατοειδικών αντιγόνων, θα μπορούσαν να διαλευκάνουν το ρόλο των ειδικών αντι-Ρ36 AAA στην παθογένεση και στην εξέλιξη της νόσου.