Θεραπευτική αντιμετώπιση ασθενών με κακοήθη νεοπλάσματα του μυοσκελετικού συστήματος: Συνδυασμένη εφαρμογή γενετικής ανάλυσης και in vitro δοκιμασίας χημειοθεραπευτικών για την ορθή επιλογή δραστικού χημειοθεραπευτικού

Abstract

During the previous two decades several assays have been developed aiming to select the most effective chemotherapy regimen for each individual, avoiding the possible toxicity of ineffective drugs. In order to evaluate cytotoxic treatment for patients with osteosarcoma, we applied an in vitro chemoresistance assay by culturing tumour cells and determining their in vitro survival rates after exposure to various chemotherapeutic drugs. The conditions of the assay were optimised in two established osteosarcoma cell lines (KHOS, U2-OS and Saos2) as compared with data derived after treatment of primary normal adult osteoblasts. Chemotherapeutic drugs (cisplatin, adriamycin or methotrexate or combinations) concentrations were chosen in a range that has been reported to induce tumour cell death in the plasma patients. The method applied successfully in 6 cell cultures originated from biopsies of 7 patients with osteosarcoma and the in vitro response to chemotherapeutic drugs was correlated with the clinical outcome. Such analysis revealed both positive and negative correlation of the in vitro data to the patients' clinical responses. Moreover, analysis of genes which, are related to chemoresistance (mdr l, gst-π) showed no any relevance with the patients' reaction to the chemotherapy. However, another gene, that of apolipoprotein J (apoJ), which has been shown to inhibit apoptosis, showed an increased RNA expression after the drug treatment of the osteosarcoma cell lines and four of the patients' biopsies. In addition, KHOS cells clones with increased resistance to adriamycin over-express ApoJ, suggesting that gene induction confines to the cytotoxicity survived cells. To further demonstrate that apoJ plays a cytoprotective role, stable transfected KHOS and U2-OS cell lines, over-expressing ApoJ protein, were produced. These cell lines exhibited significantly higher resistance rates to the cytotoxic effect of adriamycin and taxol. These data demonstrate that ApoJ exerts a cytoprotective role in response to drugs induced cytotoxicity, thus opening up new directions for studying survival mechanisms in both normal and cancer cells.

Ένας από τους πιο διαδεδομένους τρόπους αντιμετώπισης του καρκίνου είναι η χρήση χημειοθεραπευτικών που συνήθως χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με άλλους τρόπους θεραπείας. Αν και τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα έχουν εξελιχθεί ιδιαιτέρως τα τελευταία χρόνια, ένα συχνό πρόβλημα που παρουσιάζετε είναι η ανάπτυξη ανθεκτικών κυτταρικών πληθυσμών στα διάφορα φαρμακευτικά σχήματα. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να αναπτύξει μία in vitro μέθοδο που θα μπορεί να προσδιορίζει το αποτελεσματικότερο χημειοθεραπευτικό σχήμα για κάθε ασθενή. Τα βασικά στάδια αυτής της μεθόδου είναι η συλλογή βιοψίας από τον κάθε ασθενή, η κυτταρική καλλιέργεια των δειγμάτων, η δοκιμασία διαφόρων χημειοθεραπευτικών, η γενετική ανάλυση δεικτών που συνδέονται είτε με τον μηχανισμό της χημειοαντοχής είτε με τα αίτια του συγκεκριμένου τύπου του καρκίνου και τέλος η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Οι παράμετροι της in vitro δοκιμασίας χημειοαντοχής προσδιορίσθηκαν σε τρεις οστεοσαρκωματικές κυτταρικές σειρές (KHOS, U2-OS, Saos2) και σε φυσιολογικούς οστεοβλάστες (HOBS). Οι κυτταρικές καλλιέργειες που προκύπτουν από βιοψίες ασθενών με καρκίνο υποβάλλονται σε συγκεντρώσεις διαφόρων χημειοθεραπευτικών που αντιστοιχούν στις in vivo δοσολογίες για 24 ώρες. Εβδομήντα-δύο ώρες μετά, αξιολογείται η δράση των διαφόρων ουσιών και συνδυασμών αυτών, όπως επίσης απομονώνεται και ολικό RNA για περαιτέρω γενετικές αναλύσεις. Η δοκιμασία αυτή εφαρμόστηκε σε βιοψίες ασθενών με πρωτογενή οστεοσαρκώματα, όπου το 90% των δειγμάτων προσαρμόστηκαν στις συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας. Η δοκιμασία τριών χημειοθεραπευτικών ουσιών (cisplatin, adriamycin και methotrexate) και συνδυασμός αυτών (cisplatin και adriamycin) έδειξε 50% αντιστοιχία με την κλινική εικόνα των ασθενών. Σε γενετικές αναλύσεις όπου μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου της πολυφαρμακευτικής αντίστασης (mdrJ) όπως και της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (gst) δεν παρατηρήθηκε αντιστοιχία της έκφρασης των γονιδίων και της κλινικής εικόνας των ασθενών. Στα πλαίσια αναζήτησης των μηχανισμών που συνδέονται με την ανθεκτικότητα των κυττάρων στα διάφορα χημειοθεραπευτικά, παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του mRNA επιπέδου της απολιποπρωτεΐνης J (ApoJ) αυξάνεται μετά τη χρήση χημειοθεραπευτικών ουσιών στις οστεοσαρκωματικές κυτταρικές σειρές όπως και στις καλλιέργειες που προέκυψαν από τους ασθενείς με τα οστεοσαρκώματα. Το γονίδιο αυτό έχει συνδεθεί με ένα μεγάλο αριθμό κυτταρικών λειτουργιών με πιο σημαντική αυτή της απόπτωσης. Για το προσδιορισμό του ρόλου του apoJ σαν επιβιωτικός παράγοντας έναντι της κυτταροτοξικότητας που επάγουν τα διάφορα χημειοθεραπευτικά, αρχικά δημιουργήθηκαν ανθεκτικές κυτταρικές σειρές στην adriamycin (S1-S4) όπου παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του γονιδίου αυξάνεται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Περαιτέρω το γονίδιο υπερεκφράστηκε με σταθερές επιμολύνσεις στις δύο οστεοσαρκωματικές σειρές, KHOS και U2-OS και στη συνέχεια εξετάσθηκε η ανθεκτικότητα κυτταρικών κλώνων που προέκυψαν. Η υπερέκφραση του γονιδίου του apoJ αύξησε δραματικά την ανθεκτικότητα των κυττάρων στη δράση δυο χημειοθεραπευτικών της adriamycin και της taxol. Στη συνέχεια, εξετάσθηκε η έκφραση διαφόρων πρωτεϊνών που συνδέονται είτε με την απόπτωση είτε με τη χημειοαντοχή στους κλώνους που υπερεκφράζουν το apoJ. Δεν βρέθηκε διαφορά στις εκφράσεις των bcl2, gst-π, mdr l και p16 πρωτεϊνών. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα αλλά και προηγούμενα πειράματα φαίνεται ότι το apoJ έχει ένα σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων όταν αυτά υποβάλλονται είτε σε κυτταροτοξικούς παράγοντες είτε σε άλλες καταστάσεις stress. Στη τελευταία φάση, σαν εναλλακτικός τρόπος θεραπείας, μελετήθηκε αν η υπερέκφραση των αναστολέων των εξειδικευμένων κινασών των κυκλινών θα ήταν ικανή να μειώσει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων. Η υπερέκφραση του p21 σταμάτησε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων δείχνοντας ένα πιθανό τρόπο μελλοντικής θεραπείας του καρκίνου.