Ανάπτυξη αναλυτικών μεθοδολογιών για τη μελέτη βιογενών υλικών με χρήση φασματοσκοπικών τεχνικών

Abstract

Biogenic materials are composites developed through a series of biological reactions(biomineralization). The term refers to both physiological and to pathological formations as well. Biogenic materials have been the subject of many and extended interdisciplinary investigations since the nineteenth century. Calcium phosphates, calcium carbonates, calcium oxalates, silicon, iron and calcium sulfate are some of the most common cases inorganic compounds of biogenic materials. Their occurrence is common in a number of organisms (shells, mollusks, plants) and in the human body (teeth, bones, urinary stones). In the present work new non-destructive methodologies were developed for the study three different classes of biogenic materials. Three different techniques were employed for the quantitative analysis of mixtures of crystalline materials; X-Ray Diffraction and two vibrational techniques (Raman Spectroscopy, Infrared Spectroscopy). In the case of calcium carbonate polymorphs (calcite, aragonite, vaterite), a nondestructive methodology based on the use of Fourier Transform Raman Spectroscopy (FT-RS), for the discrimination and the quantitative determination of the crystal phases in their ternary mixtures, was developed. Using binary mixtures from known quantities of the crystal phase the calibration curves were constructed using the Raman bands at 711cm⁻¹ for calcite, 700cm⁻¹ for aragonite and 750cm⁻¹ for vaterite. Detection limits (DL) were found to be 0.13, 0.18 and 1.3mol % for calcite, aragonite and vaterite, respectively, while the relative errors in determining the mol % of a known ternary mixture of calcium carbonate polymorphs were 1.6% for calcite, 0.3% for aragonite and 1.1% for vaterite. Similar methodology was developed using XRD. XRD calibration curves were constructed using the 104 reflection for calcite, the 221 reflection for aragonite and the 110 reflection of vaterite. Detection limits for calcite, aragonite and vaterite were found to be 0.90, 2.90, 6.90mol %, respectively, while the relative errors in determining the mol% of the same ternary mixture used for testing the FT-RS methodology were 2.5, 1.8 and 0.6%, for calcite, aragonite and vaterite, respectively. Infrared spectroscopy was used, in order to determinate the absolute concentration of the calcium carbonate crystal phases, using the bands at 714cm⁻¹ for calcite, at 700cm⁻¹ and 714cm⁻¹ for aragonite and at 745cm⁻¹ for vaterite. The asborptivities were found to be a7 1 4= 63.38 for calcite, α7 0 0= 19.30 and α7 1 4= 40.43 for aragonite and a745 =21.79 for vaterite. The detection limits were also established and found to be D.L.™ =6.6 x 10⁻⁴ for calcite, D.L.™ = 2.2 x 10⁻³ and D.L.™ = 1.1 x 10⁻³ for aragonite and D.L.™ = 1.9 x 10⁻³ for vaterite. A non-destructive analytical method based on the use of Fourier-Transform Raman Spectroscopy (FT-RS) was developed for the identification and the quantitative analysis of hydroxyapatite (HAP) and collagen (COL) in bones. A calibration curve based on the Raman spectra of known powder mixtures of HAP - COL was constructed using the Raman bands at 960cm"1 for HAP and 2937cm"1 for COL. It was found that: Ι⁹⁶⁰/Ι²⁹³⁷ = 0.46/Wc - 0.36 where Ι⁹⁶⁰ and Ι²⁹³⁷ are the relative intensities for the 960cm⁻¹ and 2937cm⁻¹ Raman bands, respectively, and Wc represents the weight fraction of collagen. The detection limit for HAP and COL was found to be 2.8wt% and 0.6wt%, respectively. The potential of using RS for an in vitro point-by-point analysis ("mapping") of bones was demonstrated successfully on an artificially de-mineralized ox femur sample. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Fourier Transform Raman Spectroscopy (FTRS) were used in order to characterize the encrusted deposits formed onto a metallic prostatic stent. A urinary stone entrapped within the lumen was also analyzed. Six different substances were detected: hydroxyapatite, struvite, calcium oxalate monohydrate, potassium urate, ammonium urate and uric acid. A combination of the two techniques was necessary for the qualitative analysis of the encrustation and the stone, since Infrared Spectroscopy cannot be used for the discrimination between potassium urate and ammonium urate, while Raman Spectroscopy cannot be used for the identification of uric salts.

Τα βιογενή υλικά σχηματίζονται από κατεξοχήν βιολογικές διεργασίες (biomineralization)στους ζωντανούς οργανισμούς αλλά και στη φύση. Οι παραπάνω διεργασίες περιλαμβάνουν το φυσιολογικό σχηματισμό καθώς και την παθολογική δημιουργία τους. Ως περιπτώσεις βιογενών υλικών αναφέρουμε το φωσφορικό ασβέστιο, το ανθρακικό ασβέστιο, το οξαλικό ασβέστιο, το βιογενές πυρίτιο, τον βιογενή σίδηρο, και το θειικό ασβέστιο. Η παρουσία των παραπάνω είναι συχνή τόσο στην φύση (κοχύλια, μαλάκια, φύλλα φυτών), όσο και στους ζωντανούς οργανισμούς (οστά, δόντια, νεφρικοί λίθοι). Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής έγινε προσπάθεια για την ανάπτυξη μη καταστροφικών αναλυτικών μεθοδολογιών για την μελέτη ορισμένων κατηγοριών βιογενών υλικών. Μελετήθηκαν τρεις διαφορετικές κατηγορίες βιογενών υλικών και πιο συγκεκριμένα οι τρεις φάσεις του άνυδρου κρυσταλλικού ανθρακικού ασβεστίου (α-σβεστίτης-αραγωνίτης-βατερίτης), τα άλατα του φωσφορικού ασβεστίου δίδοντας έμφαση στην παρουσία του υδροξυαπατίτη στο οστό και οι ενώσεις που δημιουργούνται κατά την λιθίαση του ουροποιητικού συστήματος. Η Φασματοσκοπία Raman, η Φασματοσκοπία Υπερύθρου καθώς και η Περίθλαση Ακτινών Χ ήταν οι τρεις αναλυτικές τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν σαν βάση για την ανάπτυξη των ανάλογων αναλυτικών μεθοδολογιών.Στην περίπτωση του άνυδρου κρυσταλλικού ανθρακικού ασβεστίου χρησιμοποιήθηκαν και οι τρεις προαναφερόμενες τεχνικές με στόχο την ταυτοποίηση και την ποσοτική ανάλυση σε περιπτώσεις ταυτόχρονης συνύπαρξης και των τριών φάσεων. Η χρήση της Φασματοσκοπίας Raman οδήγησε στην ανάπτυξη μιας μη καταστροφικής αναλυτικής μεθοδολογίας, στην οποία όμως μόνο τα σχετικά ποσοστά των τριών φάσεων έγινε δυνατόν να προσδιοριστούν. Για την δημιουργία των ευθειών αναφοράς, κατασκευάστηκαν δυαδικά μίγματα, ενώ χρησιμοποιήθηκαν οι κορυφές στα 711cm⁻¹ για τον ασβεστίτη, στα 700cm⁻¹ για τον αραγωνίτη και στα 750cm⁻¹ για τον βατερίτη. Τα όρια ανίχνευσης προσδιορίστηκαν 0.13mol%, 0.18mol% και 1.3mol% για τον ασβεστίτη, αραγωνίτη και βατερίτη αντίστοιχα, ενώ τα σφάλματα κατά τον προσδιορισμό τριαδικού μίγματος γνωστής σύστασης βρέθησαν να είναι 1.6mol% για τον α-σβεστίτη, 0.3mol% για τον αραγωνίτη και 1.1mol% για τον βατερίτη. Στην προσπάθεια επιλογής των κατάλληλων δονήσεων Raman, έγινε μελέτη των φασμάτων Raman των καθαρών κρυσταλλικών φάσεων και απόδοση των κορυφών. Ανάλογη μεθοδολογία αναπτύχθηκε μέτρηση της Περίθλασης Ακτινών Χ. Οι ευθείες αναφοράς δημιουργήθηκαν με χρήση των ανακλάσεων στα 104 για τον ασβεστίτη, στα 221 για τον αραγωνίτη και στα 110 για τον βατερίτη. Τα όρια ανίχνευσης βρέθησαν να είναι 0.90mol%, 2.90mol%, 6.90mol% για τον ασβεστίτη, αραγωνίτη, βατερίτη αντίστοιχα, ενώ τα σφάλματα κατά τον προσδιορισμό τριαδικού μίγματος γνωστής σύστασης βρέθησαν να είναι 2.5mol% για τον ασβεστίτη, 1.8mol% για τον αραγωνίτη και 0.6mol% για τον βατερίτη. Τέλος με την χρήση της Φασματοσκοπίας IR έγινε δυνατός ο προσδιορισμός των απόλυτων ποσοστών των τριών φάσεων, κάνοντας χρήση των δονήσεων στα 714cm⁻¹ για τον ασβεστίτη, στα 700cm⁻¹ και 714cm⁻¹ για τον αραγωνίτηκαι στα 745cm⁻¹ για τον βατερίτη. Οι απορροφητικότητες των κορυφών (σε mg⁻¹CaCO₃ mm⁻²) βρέθηκαν ίσες με: α₇₁₄ =63.38 για τον ασβεστίτη, α₇₀₀ =19.30 και α₇₁₄ =40.43 για τον αραγωνίτη και α₇₄₅ =21.79 για τον βατερίτη. Τα όρια ανίχνευσης (σε mg CaCO₃/mm²) προσδιορίστηκαν σε: O.A.C^714 = 6.6 x 10⁻⁴ για τον ασβεστίτη, Ο.Α.A^700 =2.2 x 10⁻³ και Ο.Α.Α^714 = 1.1 x 10⁻³ για τον αραγωνίτη και Ο.Α.V^745 = 1.9 x 10⁻³ για τον βατερίτη. Στη δεύτερη κατηγορία βιογενών υλικών δόθηκε έμφαση στην μελέτη του οστού, που αποτελείται κυρίως από υδροξυαπατίτη και κολλαγόνο τύπου Ι. Συγκεκριμένα δημιουργήθηκε εύχρηστη αναλυτική μη καταστροφική μεθοδολογία βασισμένη στην Φασματοσκοπία Raman, με στόχο τον ποσοτικό έλεγχο των κύριων συστατικών του οστού. Οι δονήσεις στα 960cm⁻¹ (υδροξυαπατίτης) και 2937cm⁻¹ (κολλαγόνο) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της μεθοδολογίας. Βρέθηκε ότι Ι⁹⁶⁰/Ι²⁹³⁷ = 0.46/Wc - 0.36 όπου Wc το ποσοστό κατά βάρος του κολλαγόνου. Τα όρια ανίχνευσης προσδιορίστηκαν σε 2.8%κ.β. και 0.6%κ.β. για τον υδροξυαπατίτη και το κολλαγόνο αντίστοιχα. Η επιτυχής σημείο προς σημείο ανάλυση (χαρτογράφηση) ενός τεχνητά απομεταλλωμένου οστού επιβεβαίωσε την αξιοπιστία της προτεινόμενης μεθοδολογίας, καθώς και την δυναμική της χρησιμοποιούμενης τεχνικής. Τέλος η συνδυασμένη χρήση της Φασματοσκοπίας Υπερύθρου και Raman επιλέγη για την μελέτη των επικαθήσεων σε ενδοπροστατικό μεταλλικό εμφύτευμα, το οποίο εισάγεται σε ασθενείς με υπερπλασία του προστάτη. Μελετήθηκε ο σφηνωμένος λίθος (ο πυρήνας και το εξωτερικό του τμήμα) στο κέντρο του εμφυτεύματος, καθώς και τα δύο τμήματα του δακτυλίου (σε επαφή με το εμφύτευμα και τον λίθο) και ανιχνεύθησαν πλήθος συστατικών υδροξυαπατίτης, στρουβίτης, μονοένυδρο οξαλικό ασβέστιο, ουρικό κάλιο, ουρικό αμμώνιο και ουρικό οξύ). Από την σύγκριση των αποτελεσμάτων γίνεται φανερό ότι η συνδυασμένη χρήση των δύο δονητικών τεχνικών είναι απαραίτητη μια και η Υπέρυθρη Φασματοσκοπία δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί, για την διάκριση μεταξύ ουρικού καλίου και ουρικού αμμωνίου, ενώ η διάκριση των ουρικών αλάτων με την Φασματοσκοπία Raman είναι αδύνατη κατά την ταυτόχρονη παρουσία τους.