Γαλακτοζύλο-βιομιμητικές χρωστικές και εφαρμογές τους στον καθαρισμό ενζύμων που αναγνωρίζουν τη γαλακτόζη

Abstract

The biological ligands have been often used in affinity chromatography for the purification and separation of macromolecules. These ligands are characterised by high selectivity, but at the same time they have some disadvantages concerning the difficulty of synthesis, the reduced stability and the increased cost. Commercial reactive triazine dyes have, also, been widely used in affinity chromatography for the purification of many different enzymes. These molecules exhibit many advantages, compared to the biological ligands, such as ability of interaction with a great number of proteins, chemical and biological stability, as well as ease of immobilization. Their sole disadvantage is probably their moderate selectivity against the target molecules. That was the reason which soon led to the necessity of evolving the dye molecules, in order to improve their selectivity. The result was the birth of the biomimetic dyes, whose design is based upon the modification of the original reactive dye molecules by the introduction of new structural biomimetic moieties. The new molecules have the ability to mimic the way of interaction of the natural ligands with the target enzymes. In the present study, the biomimetic dye concept has been applied to the design and synthesis of ligands that interact with galactose-recognizing enzymes. Four biomimetic dye-ligands have been purpose-designed - by applying biocomputing and molecular modeling techniques, in order to potentially present higher affinity for the target enzymes, in comparison to the non-biomimetic dye-ligands - synthesized and purified by column liquid chromatography or preparative thin layer chromatography (preparative TLC). The new molecules were characterized by liquid paper chromatography, TLC, NMR and MS, and the values of the maximum absorbance wavelength Q.max) and the molar adsorption coefficient Vilmafix Blue A-R (VBAR) was used as the parent (original) dye for the synthesis of the biomimetic dyes. The new molecules were synthesized by nucleophilic substitution of the active triazine ring by galactose-analogues, since galactose is the natural substrate of the target enzymes. Biomimetic dye-ligands designed for GAO comprise only one enzyme recognition moiety, the terminal biomimetic moiety (galactose analogue). On the contrary, biomimetic dye-ligands designed for GalDH comprise of two enzyme-recognition moieties. The first one is the chromophore anthraquinone moiety, which acts as a nucleotide coenzyme pseudo-analogue of dehydrogenases, while the second one is the terminal biomimetic moiety (galactosamine, shikimic acid), which acts as an analogue of the enzyme natural substrate. As far as the biomimetic dye-ligands for GalDH are concerned, a hydrophilic spacer arm was interposed between the molecule and the matrix support, in order to overcome steric hindrance effects. A second, shorter linking bridge was, also, interposed between the triazine ring and the final biomimetic moiety, in order to ameliorate the interaction of the ligand with the enzyme. Both biomimetic and non-biomimetic dye-ligands were immobilised on a cross-linked agarose support and the adsorbents produced were evaluated for their chromatographic behavior against the enzymes they were designed for. The ability of the new adsorbents to purify the enzymes, starting from crude biological extracts, was also evaluated, and their superiority against the non-biomimetic ligands was demonstrated. As far as galactose oxidase from Dactylium dendroides is concerned, the best adsorbent proved to be GAO-BM1 (final biomimetic moiety: 1 -amino- l-deoxy-/β-D-galactose), while the most effective adsorbents for galactose dehydrogenase from Pseudomonas fluoresceins proved to be GalDH-BMl (final biomimetic moiety: D(+)-galactosamine) and GalDH-BM2 (final biomimetic moiety: shikimic acid). These three adsorbents were used in the chromatographic purification of the respective enzymes. The purification procedures were accomplished in two chromatographic steps using a combination of ion-exchange chromatography and affinity chromatography on the respective adsorbents. The GAO-BM1 adsorbent led to 39.7-fold purification, 2038 units/mg and 73.6% recovery for GAO, GalDH-BMl adsorbent led to 979.1-fold purification, 1077 units/mg and 97.2% recovery for GalDH, while GalDH-BM2 adsorbent led to 776.4-fold purification, 854 units/mg and 94.6% recovery for GalDH. These enzyme preparations were of high purity and shown to be homogeneous after SDS-PAGE analysis. Furthermore, the KD and capacity values of the biomimetic adsorbents GAO-BM1, GalDHBM1 and GalDH-BM2 were calculated by means of analytical affinity chromatography. The KD values were 45.8 μΜ, 5.9 μΜ and 15.4 μΜ, respectively, while the adsorbent capacity values were 708.8 units/ml adsorbent (472.5 units/μmol dye), 18.0 units/ml adsorbent (15.2 units/μmol dye) and 6.0 units/ml adsorbent (5.3 units/umol dye), respectively. Finally, an effort was made to exploit the GalDH biomimetic adsorbents in the purification of the same enzyme from other sources. Only GalDH-BMl adsorbent exhibited some purifying ability for GalDH from yeast extract (maximum purification: 9.3-fold, maximum recovery: 44.1%, in a single chromatographic step) and green peas (21.9-fold purification, 32.1% recovery, in two chromatographic steps), thus, verifying its purpose-designed high selectivity for GalDH from Pseudomonas fluorescens.

Οι βιολογικοί δεσμευτές έχουν συχνά χρησιμοποιηθεί στη χρωματογραφία συγγενείας για τον καθαρισμό και διαχωρισμό μορίων. Χαρακτηρίζονται από αρκετά υψηλή εκλεκτικότητα, αλλά ταυτόχρονα εμφανίζουν μειονεκτήματα που αφορούν στην δυσκολία σύνθεσης, τη μειωμένη σταθερότητα ή το αυξημένο κόστος. Οι εμπορικές δραστικές τριαζινικές χρωστικές έχουν, επίσης, χρησιμοποιηθεί ευρέως στη χρωματογραφία συγγενείας για τον καθαρισμό πολλών διαφορετικών ενζύμων. Τα μόρια αυτά συγκεντρώνουν αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με τους βιολογικούς δεσμευτές, όπως ικανότητα αλληλεπίδρασης με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών, χημική και βιολογική σταθερότητα, καθώς και ευκολία ακινητοποίησης. Το μοναδικό τους, ίσως, μειονέκτημα είναι η μέτρια εκλεκτικότητα που εμφανίζουν ως προς τα μόρια-στόχους. Αυτός ήταν και ο λόγος που σύντομα έγινε φανερή η ανάγκη εξέλιξης των χρωστικών, ώστε να αυξηθεί η εκλεκτικότητα τους. Έτσι προέκυψαν οι βιομιμητικές χρωστικές, των οποίων ο σχεδιασμός στηρίζεται στην τροποποίηση των μορίων των δραστικών χρωστικών, με την εισαγωγή νέων δομικών μονάδων. Τα νέα μόρια μπορούν και μιμούνται τον τρόπο αλληλεπίδρασης των φυσιολογικών δεσμευτών με τα ένζυμα-στόχους. Στην παρούσα μελέτη έγινε εφαρμογή της ιδέας των βιομιμητικών χρωστικών στο σχεδιασμό και τη σύνθεση δεσμευτών που αλληλεπιδρούν με ένζυμα που αναγνωρίζουν τη γαλακτόζη. Τέσσερις βιομιμητικές χρωστικές σχεδιάστηκαν - εφαρμόζοντας μοριακό μοντελισμό, ώστε να παρουσιάζουν υψηλότερη συγγένεια ως προς τα ένζυμα-στόχους σε σχέση με τις μη-βιομιμητικές χρωστικές - συνετέθησαν και καθαρίστηκαν μέσω υγρής χρωματογραφίας στήλης ή παρασκευαστικής χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (preparative TLC). Τα νέα μόρια χαρακτηρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία χάρτου, TLC, NMR και MS, ενώ προσδιορίστηκαν οι τιμές του μέγιστου μήκους κύματος απορρόφησης (λmax) και του συντελεστή μοριακής απόσβεσης (ε) της κάθε χρωστικής. Ως πρόδρομη ένωση για τη σύνθεση των βιομιμητικών χρωστικών χρησιμοποιήθηκε η εμπορική διχλωροτριαζινο-χρωστική Vilmafix Blue A-R (VBAR). Τα νέα μόρια προέκυψαν ύστερα από νουκλεόφιλη υποκατάσταση του δραστικού τριαζινικού δακτυλίου με ανάλογα του φυσικού υποστρώματος των ενζύμων-στόχων, δηλαδή της γαλακτόζης. Σε ό,τι αφορά στις βιομιμητικές χρωστικές που σχεδιάστηκαν για τη GAO, αυτές περιέχουν ένα λειτουργικό τμήμα αλληλεπίδρασης με το ένζυμο, τον τελικό, δηλαδή, βιομιμητικό υποκατάστατη (ανάλογο της γαλακτόζης). Οι βιομιμητικές χρωστικές που σχεδιάστηκαν για τη GalDH, αντίθετα, διαθέτουν δύο περιοχές αλληλεπίδρασης με το ένζυμο. Η πρώτη είναι το ανθρακινονικό χρωμοφόρο, το οποίο λειτουργεί ως ψευδοανάλογο του νουκλεοτιδικού συνενζύμου των αφυδρογονασών, ενώ η δεύτερη είναι ο τελικός υποκατάστατης που δρα ως ανάλογο του φυσικού υποστρώματος του ενζύμου (γαλακτοζαμίνη, σικιμικό οξύ). Στην περίπτωση των βιομιμητικών χρωστικών της GalDH κρίθηκε απαραίτητη η παρεμβολή ενός υδρόφιλου βραχίονα μεταξύ του μορίου και του φορέα, προκειμένου να μην υπεισέρχεται στερεοχημική παρεμπόδιση. Ταυτόχρονα, παρεμβλήθηκε μία γέφυρα μεταξύ του τριαζινικού δακτυλίου και του τελικού υποκατάστατη, ώστε να βελτιστοποιηθεί η αλληλεπίδραση του δεσμευτή με το ένζυμο. Τόσο οι βιομιμητικές, όσο και οι μη-βιομιμητικές χρωστικές ακινητοποιήθηκαν σε φορέα αγαρόζης και έγινε εκτίμηση της χρωματογραφικής συμπεριφοράς των προσροφητών που προέκυψαν ως προς τα αντίστοιχα ένζυμα. Έγινε εκτίμηση της ικανότητας των νέων προσροφητών να καθαρίζουν τα ένζυμα, ξεκινώντας από ακατέργαστα βιολογικά εκχυλίσματα και φάνηκε η μεγαλύτερη ικανότητα καθαρισμού τους, σε σχέση με τους μη-βιομιμητικούς προσροφητές. Μεγαλύτερη ικανότητα καθαρισμού για την οξειδάση της γαλακτόζης από Dactylium dendroides εμφάνισε ο προσροφητής GAO-BM1 (τελικός υποκατάστατης: 1-αμινο-1-δεοξυ-β-D-γαλακτόζη), ενώ μεγαλύτερη ικανότητα καθαρισμού για την αφυδρογονάση της γαλακτόζης από Pseudomonas fluorescens έδειξαν οι προσροφητές GalDH-BMl (τελικός υποκατάστατης: D(+)-γαλακτόζαμίνη) και GalDH-BM2 (τελικός υποκατάστατης: σικιμικό οξύ). Οι τρεις αυτοί προσροφητές χρησιμοποιήθηκαν στο χρωματογραφικό καθαρισμό των αντίστοιχων ενζύμων. Ο καθαρισμός πραγματοποιήθηκε σεδύο χρωματογραφικά στάδια, χρησιμοποιώντας χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής καιχρωματογραφία συγγενείας στους αντίστοιχους βιομιμητικούς προσροφητές. Ο προσροφητής GAO-BM1 οδήγησε σε 39,7-φορές καθαρισμό, 2038 units/mg και 73,6% ανάκτηση για τηGAO, ο GalDH-BMl σε 979,1-φορές καθαρισμό, 1077 units/mg και 97,2% ανάκτηση για τηGalDH, ενώ ο GalDH-BM2 σε 776,4-φορές καθαρισμό, 854 units/mg και 94,6% ανάκτησηγια τη GalDH. Έτσι παραλήφθηκαν ενζυμικά παρασκευάσματα υψηλής καθαρότητας,ομοιογενή σύμφωνα με SDS-PAGE ανάλυση. Επιπλέον, έγινε υπολογισμός των τιμών Ko και χωρητικότητας των βιομιμητικών προσροφητών GAO-BM1, GalDH-BMl και GalDH-BM2 μέσω αναλυτικής χρωματογραφίας συγγενείας. Οι τιμές των Ko βρέθηκαν 45,8 μΜ, 5,9 μΜ και 15,4 μΜ, αντίστοιχα, ενώ οι χωρητικότητες των προσροφητών βρέθηκαν 708,8 units/ml προσροφητή (472,5 units/μmol χρωστικής), 18,0 units/ml προσροφητή (15,2 units/μτηοΐ χρωστικής) και 6,0 units/ml προσροφητή (5,3 units/μmol χρωστικής), αντίστοιχα. Τέλος, έγινε προσπάθεια χρησιμοποίησης των βιομιμητικών προσροφητών της GalDH στον καθαρισμό του ίδιου ενζύμου και από άλλες πηγές. Τελικά, μόνο ο GalDH-BMl επέδειξε κάποια ικανότητα καθαρισμού του ενζύμου από μαγιά (μέγιστος καθαρισμός: 9,3-φορές, μέγιστη ανάκτηση: 44,1%, σε ένα βήμα) και μπιζέλι (21,9-φορές καθαρισμός, 32,1% ανάκτηση, σε δύο βήματα), επιβεβαιώνοντας την υψηλή εκλεκτικότητα του βιομιμητικού δεσμευτή για τη GalDH από Pseudomonas fluorescens.