Η ανοσοτροποποιητική δράση του προβιοτικού Lactobacillus plantarum στην επούλωση τραύματος: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

INTRODUCTION: The primary goal of wound management is rapid closure of wounds through the formation of a functional and aesthetically acceptable scar. Wound healing is a complex biological process that progresses through four sequential and overlapping phases. The process is initiated and regulated by numerous molecules and mediators released at the wound site, which coordinate a wide range of signaling pathways until the final stage of scar remodeling. Any disruption of these mechanisms may lead to impaired healing and failure of wound closure. A wound represents a significant disturbance to the organism, as it disrupts the integrity of the skin barrier and alters the local microbiota. The topical application of probiotics, defined as living microorganisms that confer health benefits to the host, may contribute to the restoration of microbial homeostasis, thereby promoting faster and more effective healing. This beneficial effect has been demonstrated in numerous experimental studies. Among the probiotics investigated for wound healing, lactic acid bacteria, particularly Lactobacilli and Bifidobacteria, are the most frequently studied, while Lactobacillus plantarum is considered one of the best-characterized probiotic species in this field. AIM: The aim of the present study was to investigate the potential of the probiotic strain Lactobacillus plantarum UBLP-40 to improve and accelerate the healing of a clean, full-thickness surgical wound. Particular emphasis was placed on elucidating the underlying mechanisms through the evaluation of tissue mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-17), anti-inflammatory cytokines (IL-10), extracellular matrix components (α-SMA and collagens I and III), and growth factors (CTGF, PDGF, VEGF, EGF, and EGFR).MATERIALS AND METHODS: Lactobacillus plantarum UBLP-40 was used as a purified culture in the form of a dry powder with a stable concentration of 10¹¹ CFU/g. Thirty-eight healthy male Wistar rats, weighing approximately 250 g, were included in the study. Under general anesthesia and sterile conditions, six full-thickness circular excisional wounds were created on the dorsal skin of each animal using a sterile 8-mm biopsy punch. Sixteen animals were randomly allocated to the probiotic group, in which a freshly prepared probiotic paste was applied immediately after wound creation, followed by wound dressing. Sixteen animals were assigned to the placebo group, where 0.3 mL of sterile 0.9% normal saline was applied before wound dressing. Four additional animals were used for baseline measurements. Four animals from each experimental group were sacrificed on days 2, 4, 8, and 16 after injury. Tissue mRNA expression of the investigated inflammatory, wound-healing, and angiogenic factors was determined using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). RESULTS: Compared with the placebo group, tissue mRNA expression of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 was significantly reduced at all examined time points in the L. plantarum group, indicating a strong anti-inflammatory effect. TGF-β mRNA expression increased rapidly in both groups relative to baseline levels; however, in the probiotic group a moderate reduction was observed on day 4, followed by a further decrease on day 8 (p < 0.05 versus placebo). Tissue α-SMA mRNA expression showed a non-significant increase on day 4 in the probiotic group, with no overall significant differences between the two groups. Collagen I expression remained comparable between groups throughout most of the study period, except on day 16, when a significant reduction was observed in the probiotic group (p < 0.05). In contrast, collagen III expression exhibited a statistically significant increase on day 2 (p < 0.05), followed by a marked decrease below placebo levels at subsequent time points. The L. plantarum group also demonstrated an initial reduction in VEGF expression on day 2, lower than baseline values, followed by a gradual increase, although no significant differences from the placebo group were observed thereafter. Finally, EGF mRNA expression was consistently higher in the probiotic group on days 4, 8, and 16, but these differences did not reach statistical significance. CONCLUSIONS: Topical administration of Lactobacillus plantarum UBLP-40 appears to exert a strong anti-inflammatory effect during the inflammatory phase of wound healing, facilitating an earlier transition to the proliferative phase and thereby accelerating the healing process. The reduced expression of TGF-β observed between days 4 and 8 may limit excessive production of extracellular matrix components, including α-SMA and collagens types I and III, reducing the risk of hypertrophic scar formation and exerting an anti-fibrotic effect. Although a tendency toward increased expression of the growth factors EGF and VEGF was observed, these differences were not statistically significant. Therefore, the contribution of this probiotic strain to re-epithelialization and angiogenesis appears to be limited.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο κύριος στόχος στη θεραπεία των τραυμάτων είναι η ταχεία σύγκλεισή τους, με τη δημιουργία μιας λειτουργικής και αισθητικά ικανοποιητικής ουλής. Η επούλωση είναι μια πολύπλοκη, αυστηρώς εξελισσόμενη διαδικασία που ολοκληρώνεται σε τέσσερις διαδοχικές φάσεις. Η διαδικασία σηματοδοτείται από παράγοντες που εκλύονται στην περιοχή του τραύματος, ενώ οποιαδήποτε παρεκτροπή οδηγεί σε διαταραχές και αδυναμία ολοκλήρωσης, με σημαντικές συνέπειες. Το τραύμα αποτελεί σοβαρή διαταραχή για τον οργανισμό όπου διασπάται ο φυσικός φραγμός του δέρματος και προκαλείται διαταραχή του τοπικού μικροβιώματος. Η τοπική εφαρμογή προβιοτικών, ζώντων δηλαδή μικροοργανισμών με ευεργετικές ιδιότητες για την υγεία του ξενιστή, στην τραυματισμένη περιοχή συμβάλλει σημαντικά στην αντιμετώπιση της δυσβίωσης, στη διατήρηση της ομοιόστασης και στην ομαλότερη εξέλιξη της επουλωτικής διαδικασίας, όπως έχει αποδειχθεί με πολλές πειραματικές μελέτες. Τα συχνότερα στελέχη προβιοτικών που έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες για την επούλωση δερματικού τραύματος είναι τα οξυγαλακτικά βακτήρια, ενώ ο Lactobacillus plantarum αποτελεί ένα από τα καλύτερα μελετημένα προβιοτικά, όσον αφορά τη διαδικασία της επούλωσης. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ικανότητας του προβιοτικού στελέχους Lactobacillus plantarum UBLP-40 στη βελτίωση και επιτάχυνση της επούλωσης ενός άσηπτου, ολικού πάχους χειρουργικού τραύματος, διαμέσου της μελέτης της ιστικής έκφρασης mRNA φλεγμονωδών (TNF-α, IL-1β, IL-6 και IL-17), αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-10), επουλωτικών (α-SMA και κολλαγόνο Ι και ΙΙΙ) και αυξητικών παραγόντων (CTGF, PDGF, VEGF, EGF και EGFR). ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Lactobacillus plantarum UBLP-40 σε καθαρή καλλιέργεια, χωρίς έκδοχα, με τη μορφή ξηρής σκόνης, σταθερής περιεκτικότητας (1011 cfu/gr). Χρησιμοποιήθηκαν τριάντα οκτώ (38) άρρενες υγιείς επίμυες Wistar, σωματικού βάρους περίπου 250gr, στη ράχη των οποίων πραγματοποιήθηκαν, υπό γενική αναισθησία και άσηπτες συνθήκες, εκτομή έξι κυκλικών τεμαχίων δέρματος ολικού πάχους. Δεκαέξι (16) πειραματόζωα τυχαιοποιήθηκαν στην ομάδα του προβιοτικού, στην οποία έγινε επάλειψη των τραυμάτων με την προβιοτική κρέμα αμέσως μετά την αφαίρεση των ιστοτεμαχίων του δέρματος και ακολούθησε επικάλυψη με επιδεσμικό υλικό. Στην ομάδα ελέγχου περιλήφθηκε ίσος αριθμός πειραματόζωων, στα οποία πραγματοποιήθηκε ενστάλαξη 0.3 mL φυσιολογικού ορού 0.9% (εικονικός παράγοντας) και ακολούθησε επικάλυψη με επιδεσμικό υλικό. Τέσσερα πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν για τις βασικές μετρήσεις. Τέσσερα πειραματόζωα από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν κατά τις ημέρες 2, 4, 8 και 16 για τη μελέτη της ιστικής έκφρασης mRNA των μελετώμενων παραγόντων, με την τεχνική της qRT-PCR. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τη σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων σε κάθε χρονική στιγμή φάνηκε ότι στην ομάδα L. plantarum η ιστική έκφραση mRNA των φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β και IL-6 είναι σημαντικά μειωμένη, σε όλες τις χρονικές στιγμές. Η έκφραση mRNA του TGF-β αυξάνει ταχύτατα και στις δύο ομάδες σε σχέση με τη βασική μέτρηση, όμως στην ομάδα L. plantarum παρατηρήθηκε μέτρια ελάττωση της έκφρασής του κατά την 4η ημέρα, με περαιτέρω μείωση κατά την 8η ημέρα (p<0.05 σε σύγκριση με το placebo). Η ιστική mRNA έκφραση της α-SMA, αν και παρουσίασε αύξηση στατιστικά μη σημαντική στην ομάδα του L. plantarum την 4η ημέρα, κυμάνθηκε χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Η έκφραση του κολλαγόνου Ι κυμάνθηκε, επίσης, χωρίς σημαντικές μεταβολές εκτός από την ημέρα 16, κατά την οποία παρατηρήθηκε μεγάλη πτώση (p<0.05) στην ομάδα L. plantarum. Αντίθετα, η έκφραση του κολλαγόνου ΙΙΙ στην ομάδα του L. plantarum σημείωσε στατιστικά σημαντική αύξηση (p<0.05), κατά την ημέρα 2, με αιφνίδια και μεγάλη πτώση κάτω από τις αντίστοιχες τιμές του placebo στις επόμενες χρονικές στιγμές των μετρήσεων. Η ομάδα του L. plantarum επέδειξε αρχικά (ημέρα 2) μια σημαντική ελάττωση της έκφρασης του VEGF, χαμηλότερη και από τη βασική μέτρηση, η οποία σταδιακά αυξήθηκε, χωρίς, στη συνέχεια, να παρατηρείται διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Τέλος, η έκφραση mRNA του EGF αυξήθηκε στην ομάδα του προβιοτικού κατά τις ημέρες 4, 8 και 16, χωρίς η διαφορά αυτή να φτάνει σε στατιστική σημαντικότητα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Το προβιοτικό στέλεχος Lactobacillus plantarum UBLP-40 φαίνεται ότι ασκεί εξαιρετικά ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση κατά τη φάση της φλεγμονής, με συνέπεια τη βράχυνση του χρόνου σύγκλεισης του τραύματος στις αρχικές φάσεις της επούλωσης και, κατά συνέπεια, την ταχύτερη μετάβαση στις επόμενες φάσεις. Η μειωμένη έκφραση του αυξητικού παράγοντα TGF-β από την 4η έως την 8η ημέρα της μελέτης, περιορίζει την πιθανότητα ανάπτυξης υπερτροφικής ουλής, αφού ελέγχει την υπέρμετρη έκλυση των συστατικών της θεμέλιας ουσίας α-SMA και κολλαγόνων τύπου Ι και ΙΙΙ, ασκώντας ταυτόχρονα και αντι-ινωτική δράση. Αν και διαπιστώνεται σαφής αυξητική τάση στους παράγοντες EGF και VEGF, η επίδραση του προβιοτικού στις διαδικασίες της επανεπιθηλιοποίησης και της αγγειογένεσης δεν είναι σημαντική.