Αλληλεπίδραση ανθεκτικών σε αντιβιοτικά τροφιμογενών παθογόνων με το μικροβίωμα των μυδιών και του νερού εκτροφής τους

Abstract

Antimicrobial resistance (AMR) is recognized today as one of the most serious threats to public health worldwide, with the aquatic environment and shellfish products emerging as critical reservoirs and dissemination routes of resistant bacteria and resistance genes. Coastal ecosystems and mussel-farming zones receive continuous anthropogenic inputs, including urban wastewater, riverine runoff and agricultural activities, which enrich the microbiome of the water and of the reared organisms with resistant strains. Mussels, as filter-feeding organisms, filter large volumes of water and concentrate environmental microorganisms in their tissues, which makes them both indicators of the microbiological quality of the water and potential carriers of resistant pathogens to the consumer. The fate of an incoming pathogen in a given substrate depends not only on physicochemical conditions, such as temperature, but also on its interactions with the resident microbiome, which affect the growth rate and the relative prevalence of the strains. The aim of this doctoral thesis was an integrated study of the interaction of antibiotic-resistant foodborne pathogens with the microbiome of mussels and of their rearing water. Specifically, the following were investigated: (i) the sources of microbial contamination and antibiotic resistance along the mussel production chain in the Thermaic Gulf, (ii) the growth kinetics and temperature response of selected resistant and sensitive strains, (iii) the behaviour and relative prevalence of the strains in co-cultures, with or without the addition of lactic acid bacteria (LAB), and (iv) the overall composition of the bacterial community of the two substrates. Initially, Escherichia coli, coliforms and enterococci were isolated from mussel-farming units and their environment (water, sediments, river estuary, wastewater), grouped by high-resolution melting (HRM) curve analysis, identified by 16S rRNA gene analysis and Sanger sequencing, and tested for resistance against twenty antibiotics by the disc-diffusion method. Subsequently, nine selected strains (three per species, with opposing resistance phenotypes) were studied for their growth kinetics at three temperatures (12, 22 and 30 °C), by fitting the primary Baranyi & Roberts model and the secondary square-root (Ratkowsky) and Arrhenius models. The behaviour of the strains was then investigated in co-cultures, in a seawater rearing-water model and in a mussel-broth model, at different temperatures and with or without LAB. The relative prevalence of resistant versus sensitive strains was determined using antibiotics as differentiating markers, while total viable counts, populations on selective media and pH changes were monitored in parallel. Finally, selected samples from the interaction experiments were analysed by high-throughput sequencing of the 16S rRNA gene (metabarcoding). Assessment of the microbial load revealed a clear gradient among samples, with sediments and wastewater-related samples showing the highest populations, while elevated values were also recorded at the river estuary and in marsh samples, documenting the role of terrestrial and riverine inputs as contamination sources of the mussel-farming areas. Susceptibility testing revealed an extensive presence of resistant, often multidrug-resistant, strains both in the environmental samples and in mussel flesh. Resistance was frequently recorded to clindamycin, cefoxitin, ceftazidime, cephalothin, cefazolin, nalidixic acid, streptomycin, sulfonamides, penicillin G, ampicillin and vancomycin, whereas ciprofloxacin was among the most effective antibiotics. Multidrug-resistant Enterococcus spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii and Shigella flexneri were isolated, while the detection of resistant bacteria in mussel flesh showed that the burden of the environmental waters can be transferred to the edible product itself. For the study of growth kinetics, nine strains with opposing resistance phenotypes were selected (E. coli: EC194, EC4, EC102; E. faecalis: MA60, T440, T640; E. faecium: SB10, M41, T280). Temperature was the main differentiating factor: the maximum growth rate (μmax) increased from 0.055–0.072 log CFU/mL/h at 12 °C to 0.198–0.355 at 22 °C and 0.426–0.713 at 30 °C, while the lag phase was shortened or not discernible at the higher temperatures and final populations settled close to 9 log CFU/mL. A strain's superiority in μmax did not always reflect a shorter lag or a higher final population. The resistant MA60 and SB10 showed consistently higher μmax than the corresponding sensitive strains, while EC194 and EC4 maintained similar or higher kinetic performance, with the differences becoming clearer at 30 °C. The findings did not support a stable fitness cost of resistance; the change of μmax with temperature was adequately described by the square-root (Ratkowsky) model, which proved more suitable than the Arrhenius model. In the co-culture experiments, both in the rearing-water model and in the mussel-broth model, all strains survived and grew in the presence of the resident microbial population. The relative prevalence of the resistant or the sensitive phenotype proved to be predominantly strain-dependent and could not be predicted from the resistance phenotype alone; in some pairs the resistant and in others the sensitive phenotype prevailed, depending on the overall competitive ability of each strain. Temperature, the addition of lactic acid bacteria (LAB) and pH changes shaped the outcome of the interactions. In the mussel-broth model the presence of LAB was associated with marked suppression of the inoculated Escherichia coli and with a decrease in pH due to organic-acid production, whereas in the rearing water the LAB did not establish and exerted no such effect. Metabarcoding analysis by high-throughput sequencing of the 16S rRNA gene showed that the rearing water was dominated by Enterobacteriaceae/Escherichia, with the inoculated population persisting regardless of the presence of LAB, which did not establish in the water. By contrast, mussel broth hosted a richer community (Vibrio, Fusobacterium, Pseudomonas), in which the presence of LAB was associated with marked suppression of Escherichia. Temperature strongly affected the composition of the community, with Escherichia dominating at 22 and 30 °C and Vibrio becoming dominant at 12 °C, reinforcing the interpretation that the fate of resistant pathogens is shaped by the microbial community of the substrate as a whole and not only by the directly co-inoculated strains. Overall, the findings show that both rearing water and mussels can act as matrices maintaining resistant foodborne pathogens, that their fate depends on the substrate, temperature and microbial interactions, and that the relative prevalence of resistant strains is not determined solely by the resistance phenotype. Lactic acid bacteria emerge as a potential natural hurdle for control, particularly in the mussel substrate, while the strong effect of temperature underlines the importance of climatic variability for the dynamics of resistant populations. The results reinforce the need for an integrated One Health approach linking the environment, the animal product and public health.

Η αντοχή στα αντιβιοτικά (antimicrobial resistance, AMR) αναγνωρίζεται σήμερα ως μία από τις σοβαρότερες απειλές για τη δημόσια υγεία παγκοσμίως, με το υδάτινο περιβάλλον και τα οστρακοειδή προϊόντα να αναδεικνύονται σε κρίσιμες δεξαμενές και οδούς διασποράς ανθεκτικών βακτηρίων και γονιδίων αντοχής. Τα παράκτια οικοσυστήματα και οι ζώνες μυδοκαλλιέργειας δέχονται συνεχείς εισροές ανθρωπογενούς προέλευσης, μεταξύ άλλων από αστικά λύματα, ποτάμιες απορροές και γεωργικές δραστηριότητες, οι οποίες εμπλουτίζουν το μικροβίωμα του νερού και των εκτρεφόμενων οργανισμών με ανθεκτικά στελέχη. Τα μύδια, ως διηθηματοφάγοι οργανισμοί, φιλτράρουν μεγάλους όγκους νερού και συγκεντρώνουν στους ιστούς τους μικροοργανισμούς του περιβάλλοντος εκτροφής, γεγονός που τα καθιστά ταυτόχρονα δείκτες της μικροβιολογικής ποιότητας των υδάτων και πιθανούς φορείς ανθεκτικών παθογόνων προς τον καταναλωτή. Η τύχη ενός εισερχόμενου παθογόνου σε ένα υπόστρωμα δεν εξαρτάται μόνο από τις φυσικοχημικές συνθήκες, όπως η θερμοκρασία, αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις του με το φυσικό μικροβίωμα, οι οποίες επηρεάζουν τον ρυθμό ανάπτυξης και τη σχετική επικράτηση των στελεχών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν μια ολοκληρωμένη προσέγγιση της αλληλεπίδρασης ανθεκτικών σε αντιβιοτικά τροφιμογενών παθογόνων με το μικροβίωμα των μυδιών και του νερού εκτροφής τους. Ειδικότερα, διερευνήθηκαν: (i) οι πηγές μικροβιακής επιμόλυνσης και η αντοχή στα αντιβιοτικά κατά μήκος της παραγωγικής αλυσίδας των μυδιών στον Θερμαϊκό Κόλπο, (ii) η κινητική ανάπτυξης και η θερμοκρασιακή απόκριση επιλεγμένων ανθεκτικών και ευαίσθητων στελεχών, (iii) η συμπεριφορά και η σχετική επικράτηση των στελεχών σε συγκαλλιέργειες, με ή χωρίς προσθήκη οξυγαλακτικών βακτηρίων (LAB), και (iv) η συνολική σύσταση της βακτηριακής κοινότητας των δύο υποστρωμάτων. Αρχικά, στελέχη Escherichia coli, κολοβακτηριοειδών και εντερόκοκκων απομονώθηκαν από μονάδες μυδοκαλλιέργειας και το περιβάλλον τους (νερό, ιζήματα, εκβολή ποταμού, λύματα), ομαδοποιήθηκαν με ανάλυση καμπυλών τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRM), ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση και αλληλούχιση (Sanger) του γονιδίου 16S rRNA και ελέγχθηκαν ως προς την αντοχή τους έναντι είκοσι αντιβιοτικών με τη μέθοδο διάχυσης δίσκων. Στη συνέχεια, εννέα επιλεγμένα στελέχη τριών ειδών — Escherichia coli, Enterococcus faecalis και Enterococcus faecium (τρία ανά είδος, με αντίθετους φαινοτύπους αντοχής) μελετήθηκαν ως προς την κινητική ανάπτυξής τους σε τρεις θερμοκρασίες (12, 22 και 30 °C), με προσαρμογή του πρωτογενούς μοντέλου Baranyi & Roberts και των δευτερογενών μοντέλων τετραγωνικής ρίζας (Ratkowsky) και Arrhenius. Ακολούθως, η συμπεριφορά των στελεχών διερευνήθηκε σε συγκαλλιέργειες, σε μοντέλο θαλασσινού νερού εκτροφής και σε μοντέλο ζωμού μυδιών, σε διαφορετικές θερμοκρασίες και με ή χωρίς προσθήκη LAB. Η σχετική επικράτηση ανθεκτικών έναντι ευαίσθητων στελεχών προσδιορίστηκε με χρήση αντιβιοτικών ως διαφοροποιητικών δεικτών, ενώ παρακολουθήθηκαν παράλληλα η ολική μικροβιακή χλωρίδα, οι πληθυσμοί σε εκλεκτικά υποστρώματα και η μεταβολή του pH. Τέλος, επιλεγμένα δείγματα από τα πειράματα αλληλεπίδρασης αναλύθηκαν με μεταγονιδιωματική αλληλούχιση του γονιδίου 16S rRNA (metabarcoding). Ο έλεγχος της μικροβιακής επιβάρυνσης ανέδειξε σαφή διαβάθμιση μεταξύ των δειγμάτων, με τα ιζήματα και τα δείγματα που σχετίζονταν με αστικά λύματα να εμφανίζουν τους υψηλότερους πληθυσμούς, ενώ αυξημένες τιμές καταγράφηκαν και στην εκβολή του ποταμού και σε δείγματα ελώδους περιοχής, τεκμηριώνοντας τον ρόλο των χερσαίων και ποτάμιων εισροών ως πηγών επιμόλυνσης των περιοχών μυδοκαλλιέργειας. Ο έλεγχος ευαισθησίας ανέδειξε εκτεταμένη παρουσία ανθεκτικών, συχνά πολυανθεκτικών, στελεχών τόσο στα περιβαλλοντικά δείγματα όσο και στη σάρκα των μυδιών. Αντοχή καταγράφηκε συχνά στην κλινδαμυκίνη, την κεφοξιτίνη, την κεφταζιδίμη, την κεφαλοθίνη, την κεφαζολίνη, το ναλιδιξικό οξύ, τη στρεπτομυκίνη, τις σουλφοναμίδες, την πενικιλλίνη G, την αμπικιλλίνη και τη βανκομυκίνη, ενώ η σιπροφλοξασίνη ήταν μεταξύ των αποτελεσματικότερων αντιβιοτικών. Απομονώθηκαν πολυανθεκτικά στελέχη Enterococcus spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii και Shigella flexneri, ενώ η ανίχνευση ανθεκτικών βακτηρίων στη σάρκα των μυδιών έδειξε ότι η επιβάρυνση των περιβαλλοντικών υδάτων μπορεί να μεταφερθεί στο ίδιο το εδώδιμο προϊόν. Για τη μελέτη της κινητικής ανάπτυξης επιλέχθηκαν εννέα στελέχη με αντίθετους φαινοτύπους αντοχής (E. coli: EC194, EC4, EC102· E. faecalis: MA60, T440, T640· E. faecium: SB10, M41, T280). Η θερμοκρασία αποτέλεσε τον κυριότερο παράγοντα διαφοροποίησης: ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης (μmax) αυξήθηκε από 0,055–0,072 log CFU/mL/h στους 12 °C σε 0,198–0,355 στους 22 °C και 0,426–0,713 στους 30 °C, ενώ η φάση προσαρμογής (lag) περιορίστηκε ή δεν ήταν διακριτή στις υψηλότερες θερμοκρασίες και οι τελικοί πληθυσμοί διαμορφώθηκαν κοντά στα 9 log CFU/mL. Η υπεροχή ενός στελέχους ως προς τον μmax δεν αντανακλούσε πάντοτε μικρότερη φάση προσαρμογής ή υψηλότερο τελικό πληθυσμό. Τα ανθεκτικά MA60 και SB10 παρουσίασαν σταθερά υψηλότερους μmax από τα αντίστοιχα ευαίσθητα στελέχη, ενώ τα EC194 και EC4 διατήρησαν παρόμοια ή υψηλότερη κινητική απόδοση, με τις διαφορές να γίνονται σαφέστερες στους 30 °C. Τα ευρήματα δεν υποστήριξαν σταθερό κόστος προσαρμοστικότητας της αντοχής· η μεταβολή του μmax με τη θερμοκρασία περιγράφηκε ικανοποιητικά από το μοντέλο τετραγωνικής ρίζας (Ratkowsky), το οποίο αποδείχθηκε καταλληλότερο από το μοντέλο Arrhenius. Στα πειράματα συγκαλλιέργειας, τόσο στο μοντέλο νερού εκτροφής όσο και στο μοντέλο ζωμού μυδιών, όλα τα στελέχη επιβίωσαν και αναπτύχθηκαν παρουσία του φυσικού μικροβιακού πληθυσμού. Η σχετική επικράτηση του ανθεκτικού ή του ευαίσθητου φαινοτύπου αποδείχθηκε κατεξοχήν στέλεχος-εξαρτώμενη και δεν μπορούσε να προβλεφθεί αποκλειστικά από τον φαινότυπο αντοχής· σε ορισμένα ζεύγη επικράτησε ο ανθεκτικός και σε άλλα ο ευαίσθητος φαινότυπος, ανάλογα με τη συνολική ανταγωνιστική ικανότητα κάθε στελέχους. Η θερμοκρασία, η προσθήκη οξυγαλακτικών βακτηρίων (LAB) και η μεταβολή του pH διαμόρφωσαν την έκβαση των αλληλεπιδράσεων. Στο μοντέλο ζωμού μυδιών η παρουσία LAB συνδέθηκε με σαφή καταστολή του εμβολιασμένου Escherichia coli και με μείωση του pH λόγω παραγωγής οργανικών οξέων, ενώ στο νερό εκτροφής τα LAB δεν εγκαταστάθηκαν και δεν άσκησαν αντίστοιχη δράση. Η μεταγονιδιωματική ανάλυση με αλληλούχιση υψηλής απόδοσης του γονιδίου 16S rRNA έδειξε ότι το νερό εκτροφής κυριαρχούνταν από Enterobacteriaceae/Escherichia, με τον εμβολιασμένο πληθυσμό να διατηρείται ανεξαρτήτως της παρουσίας LAB, τα οποία δεν εγκαταστάθηκαν στο νερό. Αντίθετα, ο ζωμός μυδιών φιλοξενούσε πλουσιότερη κοινότητα (Vibrio, Fusobacterium, Pseudomonas), στην οποία η παρουσία LAB συνδέθηκε με έντονη καταστολή του Escherichia. Η θερμοκρασία επηρέασε καθοριστικά τη σύνθεση της κοινότητας, με το Escherichia να επικρατεί στους 22 και 30 °C και το Vibrio να γίνεται κυρίαρχο στους 12 °C, γεγονός που ενισχύει την ερμηνεία ότι η τύχη των ανθεκτικών παθογόνων διαμορφώνεται από το σύνολο της μικροβιακής κοινότητας του υποστρώματος και όχι μόνο από τα άμεσα συνενοφθαλμισμένα στελέχη. Συνολικά, τα ευρήματα δείχνουν ότι τόσο το νερό εκτροφής όσο και τα μύδια μπορούν να λειτουργήσουν ως μήτρες διατήρησης ανθεκτικών τροφιμογενών παθογόνων, ότι η τύχη τους εξαρτάται από το υπόστρωμα, τη θερμοκρασία και τις μικροβιακές αλληλεπιδράσεις, και ότι η σχετική επικράτηση των ανθεκτικών στελεχών δεν καθορίζεται αποκλειστικά από τον φαινότυπο αντοχής. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια αναδεικνύονται ως πιθανό φυσικό εμπόδιο (hurdle) ελέγχου, ιδίως στο υπόστρωμα των μυδιών, ενώ η έντονη επίδραση της θερμοκρασίας υπογραμμίζει τη σημασία της κλιματικής μεταβλητότητας για τη δυναμική των ανθεκτικών πληθυσμών. Τα αποτελέσματα ενισχύουν την ανάγκη μιας ολοκληρωμένης προσέγγισης Ενιαίας Υγείας (One Health) που συνδέει το περιβάλλον, το ζωικό προϊόν και τη δημόσια υγεία.