Αντιμικροβιακή δράση μικροφυκών

Abstract

The present dissertation aimed to evaluate the antibacterial activity of microalgae and to investigate the effect of environmental factors, such as the presence/absence of light, combination of solar radiation with high temperature, aeration or not and light quality, etc., on the inhibitory activity of microalgae. In addition, the study aimed the study aimed to isolate and chemically identify the bioactive compounds responsible for the observed antimicrobial activity. This work was carried out within the framework of the research project “ALGAVISION – Isolation and cultivation of local microalgae species from lagoons for the large-scale production of antimicrobial compounds, fatty acids, pigments, and antioxidants”, which was funded through the General Secretariat for Research and Innovation (GSRI) from national and EU funds, project code T6YBΠ00222.In total, twelve microalgal species and cyanobacteria were evaluated: Tetraselmis sp. (red var.), Tetraselmis sp. (red var., Pappas), Tetraselmis sp. (red var., Kotichi), Tetraselmis sp. (palmella), Tetraselmis marina (var. Messolonghi), Nephroselmis sp., Dunaliella salina, Asteromonas gracilis, Phormidium sp., Anabaena sp., Cyanothece sp., and Amphidinium carterae, against the fish pathogenic bacteria Aeromonas veronii, Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, and Vibrio harveyi. Results were compared with those obtained from Chlorella minutissima and Tetraselmis suecica, known for theirantibacterial properties from earlier studies.The experimental design included: (i) evaluation of antibacterial activity under different salinity and cultivation conditions, (ii) assessment of the effect of solar radiation, (iii) investigation of the influence of different light spectral regions, and (iv) isolation and chemical characterization of bioactive fractions using high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS), followed by evaluation of their antimicrobial activity. In the first series of experiments, the inhibition of all microalgae was assessed in comparison with the species C. minutissima to identify the most active species. This experimental series consisted of three stages. In the first stage, axenic cultures were grown under identical conditions (25 ppt salinity, aeration, and photoperiod) and tested in both light and dark conditions against A. veronii, V. anguillarum, and V. alginolyticus. In the second stage, cultures grew under species-specific optimal salinity conditions, under aeration and light or dark conditions, and were additionally tested against V. harveyi. All microalgae exhibited antibacterial activity. A. gracilis and Tetraselmis red var. (Pappas) showed the strongest inhibitory effects, reducing bacterial populations by1–3 log units. V. anguillarum was the most sensitive pathogen, whereas V. alginolyticuswas the most resistant. Light exposure generally enhanced antibacterial activity byapproximately 8%, indicating a possible enhancement of free oxygen radicals productionthrough photosynthesis. In the third stage, extracellular activity was evaluated using cellfree supernatants from centrifuged cultures of A. carterae, A. gracilis, Tetraselmis red var. (Pappas), Nephroselmis sp., Phormidium sp., Anabaena sp., and Cyanothece sp., under species-specific optimal salinity and aeration conditions. Tetraselmis red var. (Pappas) exhibited the highest activity, inhibiting V. anguillarum 6–21 h under light conditions (r = 0.9904), V. alginolyticus 4–25 h (r = 0.9946), and V. harveyi 21–23 h (r = 0.981). Phormidium sp. and Anabaena sp. significantly inhibited V. anguillarum at 25 hand V. alginolyticus 21–48 h (p < 0.05). A. veronii was the most resistant pathogen, as none of the examined extracellular supernatants caused significant and consistent inhibition of its growth, while V. alginolyticus and V. anguillarum were the most sensitive pathogens.In the second experimental series, the effect of direct solar radiation (high light intensity and temperature increase) was investigated in Tetraselmis red var. (Pappas) and A. gracilis, which had previously shown the strongest antibacterial activity. Antibacterial activity was evaluated against A. veronii, V. anguillarum, V. alginolyticus, and V. harveyi after exposure to solar radiation for 0, 2, and 4 hours. Tetraselmis red var. (Pappas) maintained strong inhibitory activity regardless of solar exposure, whereas A. gracilis exhibited enhanced activity after exposure, particularly after 2 hours. Specifically,Tetraselmis red var. (Pappas) showed significant inhibition against A. veronii after 2 hours of exposure (p = 0.0125). A. gracilis showed time-dependent enhancement of activity, particularly against V. alginolyticus, with inhibition observed from 6 h after incubation and reaching a maximum at 25 h.Subsequently, the effect of different light wavelengths was investigated. Tetraselmis suecica, Chlorella minutissima, and A. gracilis were cultivated under white, green, yellow, and blue light for 14 days. Antibacterial activity was evaluated on days 0, 7, and 14 against the same pathogens. The results demonstrated that blue light significantly enhanced antimicrobial activity compared with the other wavelengths. C. minutissima grown under blue light exhibited the strongest inhibitory activity against all pathogens, followed by A. gracilis and T. suecica. A. gracilis showed variable activity,with initially low or no effect that increased significantly over time, particularly under blue light. Maximum inhibition was generally observed 72–96 h of incubation, indicating time-dependent accumulation of bioactive compounds. In the third experimental series, Tetraselmis red var. (Pappas) and A. gracilis were selected for the isolation of bioactive compounds responsible for their antibacterial activity. Extraction was performed using ethyl acetate, followed by HPLC fractionation. Each fraction was tested against V. anguillarum, A. veronii, V. alginolyticus, and V. harveyi. Mass spectrometry (MS) analysis was then performed for compound identification. The most active fractions were T3 (Tetraselmis sp. red var., Pappas) and A6 (A. gracilis), which showed the strongest and most consistent antibacterial activity. Fractions T2 and A3 exhibited limited or no significant activity. Chemical analysis indicated the presence of bioactive compounds, including flavonoids (fractions Α1, Τ1), lipid derivatives such as glycerophosphoinositols and monogalactosyldiacylglycerols (MGDGs) (Α5), as well as carbohydrate- and amino sugar–related molecules (Τ2). These findings suggest that antibacterial activity is due to a complex mixture of secondarymetabolites rather than a single compound. Microalgae from the Messolonghi–Aetoliko lagoons appear to be sources of bioactive compounds, with the potential to be used as alternative solutions for pathogen control in aquaculture. Tetraselmis red var. (Pappas) and A. gracilis demonstrated strong inhibitory activity against important fish pathogenic bacteria. Environmental factors such as exposure to different wavelengths of light and solar radiation were shown to enhanceinhibitory activity. Chemical analysis confirmed the presence of fatty acids, flavonoids, and carbohydrates, highlighting the complex nature of microalgae. These results contribute to a better understanding of natural antimicrobial mechanisms in microalgae and support their potential use in sustainable aquaculture practices as alternatives to conventional antibiotics. Future research should focus on further isolation and potentialcommercial exploitation of these species.

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αξιολόγηση της αντιβακτηριακής δράσης μικροφυκών και η διερεύνηση της επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως παρουσία/απουσία φωτός, συνδυασμός ηλιακής ακτινοβολίας με υψηλή θερμοκρασία, αερισμός ήόχι και ποιότητα φωτός κ.λ.π., στην ανασταλτική δράση των μικροφυκών. Επιπλέον, στόχο αποτέλεσε και η απομόνωση και χημική ταυτοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων που ευθύνονται για την παρατηρούμενη αναστολή αύξησης των βακτηρίων. Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του ερευνητικού έργου «ALGAVISION - Απομόνωση και καλλιέργεια τοπικών ειδών φυτοπλαγκτού από λιμνοθάλασσες με απώτερο σκοπό την μαζική παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, λιπαρών οξέων, χρωστικών και αντιοξειδωτικών που χρηματοδοτήθηκε μέσω της Γενικής Γραμματεία Έρευνας και Καινοτομίας (ΓΓΕΚ) από εθνικούς και κοινοτικούς πόρους, κωδικός έργου Τ6ΥΒΠ-00222.Συνολικά, αξιολογήθηκαν δώδεκα είδη μικροφυκών και κυανοβακτηρίων: Tetraselmis sp. (red var.), Tetraselmis sp. (red var., Pappas), Tetraselmis sp. (red var., Kotichi), Tetraselmis sp. (palmella), Tetraselmis marina (var. Messolonghi), Nephroselmis sp., Dunaliella salina, Asteromonas gracilis, Phormidium sp., Anabaena sp., Cyanothece sp. και Amphidinium carterae, έναντι ιχθυοπαθογόνων βακτηρίων των ειδών Aeromonas veronii, Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus και Vibrio harveyi. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα των μικροφυκών Chlorella minutissima και Tetraselmis suecica, γνωστά για τις αντιβακτηριακές τους ιδιότητες. Η πειραματική προσέγγιση περιλάμβανε: (i) αξιολόγηση αντιβακτηριακής δράσης υπό διαφορετικές συνθήκες αλατότητας και καλλιέργειας, (ii) μελέτη της επίδρασης ηλιακής ακτινοβολίας, (iii) διερεύνηση της επίδρασης διαφορετικών φασματικών περιοχών φωτός και (iv) απομόνωση και χημική ανάλυση βιοδραστικών κλασμάτων μέσω HPLC και φασματομετρίας μάζας και διερεύνηση της αντιμικροβιακής τους δράσης. Στην πρώτη κατηγορία, αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση όλων των μικροφυκών, σε σύγκριση με το είδος C. minutissima, ώστε να εντοπιστούν τα είδη με τη μεγαλύτερη ανασταλτική δραστικότητα. Αυτή η πρώτη κατηγορία πειραμάτων χωρίστηκε σε τρία (3) στάδια μελέτης: Στην πρώτη σειρά πειραμάτων έγινε εκτίμηση της επίδρασης όμοιων συνθηκών καλλιέργειας (αλατότητα στα 25 ppt, αερισμός, φωτοπερίοδοι) στην ανασταλτική δράση των μικροφυκών Tetraselmis sp. (red var.), Tetraselmis sp. (red var., Pappas), Tetraselmis sp. (red var., Kotichi), Tetraselmis sp. (palmella), T. marina (var. Messolonghi), A. gracilis, A. carterae και D. salina, έναντι των ιχθυοπαθογόνων A. veronii, V. anguillarum, V. alginolyticus με αξενικές καλλιέργειες. Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων έγιναν δοκιμές με τις αξενικές καλλιέργειες των μικροφυκών, σε αλατότητα προσαρμοσμένη στις βέλτιστες συνθήκες κάθε είδους, υπό συνθήκες αερισμού, σε φωτεινό ή σκοτεινό περιβάλλον και συμπεριλήφθηκε στη μελέτη η δραστικότητα έναντι του παθογόνου V. harveyi. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα μικροφύκη παρουσίασαν αντιβακτηριακή δράση, με τα A. gracilis και Tetraselmis red var., Pappas να εμφανίζουν την ισχυρότερη ανασταλτική δράση, μειώνοντας τον βακτηριακό πληθυσμό κατά 1 έως 3 λογαριθμικές μονάδες, ενώ το V. anguillarum ήταν το πιο ευαίσθητο παθογόνο και το V. alginolyticus το πιο ανθεκτικό στη αντιμικροβιακή δράση των μικροφυκών. Η παρουσία φωτός ενίσχυσε γενικά τη δραστικότητα κατά περίπου 8%, υποδεικνύοντας πιθανή ενίσχυση μέσω φωτοσύνθεσης της παραγωγής ελεύθερων ριζών οξυγόνου. Στο τρίτο στάδιο μελέτης, μέσω της εξωκυτταρικής δοκιμασίας, εξετάστηκε το υπερκείμενο από φυγοκεντρημένες καλλιέργειες των μικροφυκών A.carterae, A. gracilis, Tetraselmis red var. Pappas, Nephroselmis sp. Phormidium sp., Anabaena sp. και Cyanothece sp., με αλατότητα προσαρμοσμένη στις βέλτιστες συνθήκες για κάθε είδος και υπό συνθήκες αερισμού των καλλιεργειών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Tetraselmis red var., Pappas ήταν το πιο δραστικό, παρουσιάζοντας αναστολή του V. anguillarum μεταξύ 6 και 21 ωρών υπό φωτισμό (r = 0,9904), του V. alginolyticus μεταξύ 4 και 25 ωρών υπό φωτισμό (r = 0,9946) και του V. harveyi μεταξύ 21 και 23 ωρών (r = 0,981). Τα Phormidium sp. και Anabaena sp. ανέστειλαν σημαντικά την ανάπτυξη του V. anguillarum στις 25 ώρες και του V. alginolyticus μεταξύ 21 και 48 ωρών (p < 0,05). Το A. veronii ήταν το πιο ανθεκτικό παθογόνο, καθώς κανένα από τα εξεταζόμενα εξωκυτταρικά υπερκείμενα δεν προκάλεσε σημαντική και σταθερή αναστολή της ανάπτυξής του, ενώ τα V. alginolyticus και V. anguillarum ήταν τα πιο ευαίσθητα παθογόνα. Στη δεύτερη κατηγορία πειραμάτων, διερευνήθηκε η επίδραση της άμεσης ηλιακής ακτινοβολίας (μεγάλη ένταση φωτός και άνοδος της θερμοκρασίας) για ορισμένο χρονικό διάστημα στα είδη Tetraselmis red var., Pappas και A. gracilis, τα οποία είχαν προηγουμένως παρουσιάσει την ισχυρότερη αντιβακτηριακή δράση. Η ανασταλτική δράση μελετήθηκε στα ίδια ιχθυοπαθογόνα βακτήρια (A. veronii, V. anguillarum, V. alginolyticus, V. harveyi). Η ανασταλτική δράση των μικροφυκών έναντι των παθογόνων αξιολογήθηκε σε διάφορες χρονικές στιγμές έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία (0, 2 και 4 ώρες). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Tetraselmis red var., Pappas εμφάνισε ισχυρότερη ανασταλτική δράση, ανεπηρέαστη από την ηλιακή ακτινοβολία, ενώ το A. gracilis παρουσίασε ενισχυμένη δράση μετά την έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία και κυρίως 2 ώρες μετά την έκθεση σε αυτή. Συγκεκριμένα, το Tetraselmis red var., Pappas ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματικό έναντι του A. veronii, με αναστολή έπειτα από 2 ώρες άμεσης έκθεσης στο ηλιακό φως (p=0,0125). Το A. gracilis έδειξε ενισχυμένη δράση με την πάροδο του χρόνου, ιδιαίτερα έναντι του V. alginolyticus όπου η αναστολή παρατηρήθηκε από την 6η ώρα μετά την επώαση και ήταν ιδιαίτερα ισχυρή σε t=25 ώρες επώασης. Έπειτα πραγματοποιήθηκε μελέτη υπό το φως διαφορετικών μήκων κύματος φωτός. Τα μικροφύκη T. suecica, C. minutissima και A. gracilis καλλιεργήθηκαν υπό λευκό, πράσινο, κίτρινο και μπλε φως για 14 ημέρες. Η ανασταλτική δράση τους αξιολογήθηκε την 0η, 7η και 14η ημέραέναντι των ίδιων ιχθυοπαθογόνων (A. veronii, V. anguillarum, V. alginolyticus, V. harveyi). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μπλε φως ενίσχυσε σημαντικά την ανασταλτική δράση των μικροφυκών, με στατιστικά σημαντικές διαφορές έναντι άλλων μηκών κύματος. Συγκεκριμένα, η καλλιέργεια του C. minutissima υπό μπλε φως είχε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι όλων των παθογόνων, ακολουθούμενη από το A. gracilis και το T. suecica. Το A. gracilis παρουσίασε μεταβλητή συμπεριφορά, με αρχικά χαμηλή ή ανύπαρκτη δράση, η οποία όμως ενισχύθηκε σημαντικά μετά από έκθεση, ιδιαίτερα υπό μπλε φωτισμό. Η μέγιστη ανασταλτική δράσηπαρατηρήθηκε συνήθως μεταξύ 72–96 ώρες επώασης, ανεξαρτήτως μικροοργανισμού, γεγονός που υποδηλώνει χρονικά εξαρτώμενη συσσώρευση βιοδραστικών ενώσεων. Στην τρίτη σειρά πειραμάτων επιλέχθηκαν τα Tetraselmis red var., Pappas και A. gracilis, και ακολούθησαν πειράματα για την απομόνωση των βιοδραστικών ενώσεων που θα μπορούσαν να θεωρηθούν υπεύθυνες για την ανασταλτική τους δράση. Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση χρησιμοποιώντας οξικό αιθυλεστέρα, ακολουθούμενη από υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) για τον διαχωρισμό των επιμέρους συστατικών. Κάθε εκχύλισμα εξετάστηκε ως προς την ανασταλτική του δράση έναντι των ίδιων ιχθυοπαθογόνων (V. anguillarum, A. veronii, V. alginolyticus και V. harveyi). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε φασματομετρική ανάλυση μάζας για τον προσδιορισμό των ουσιών που περιέχονται σε καθένα από αυτά τα εκχυλίσματα. Τα πλέον υποσχόμενα κλάσματα ήταν τa T3 του Tetraselmis sp. (red var., Pappas) και A6 του A. gracilis, τα οποία παρουσίασαν τη μεγαλύτερη και πιο σταθερή αντιβακτηριακή δράση έναντι όλων των εξεταζόμενων παθογόνων. Αντίθετα, τα κλάσματα T2 και A3 εμφάνισαν περιορισμένη ή μη σημαντική δραστικότητα. Η φασματομετρική ανάλυση έδειξε ότι τα κλάσματα περιέχουν διαφορετικές κατηγορίες βιοδραστικών ενώσεων που αποδίδονται σε φλαβονοειδή (κλάσματα Α1, Τ1), λιπιδικές δομές τύπου γλυκεροφωσφοϊνοσιτολών ή μονογαλακτοζυλοδιακυλογλυκερολών (MGDGs) (κλάσμα Α5), καθώς και υδατανθρακικής ή αμινοσακχαριτικής φύσης μόρια (κλάσμα Τ2). Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αντιβακτηριακή δράση των μικροφυκών οφείλεται σε ένα μείγμα δευτερογενών μεταβολιτών και όχι σε μία μεμονωμένη ένωση. Τα μικροφύκη από τις λιμνοθάλασσες Μεσολογγίου-Αιτωλικού φαίνεται να αποτελούν πηγές βιοδραστικών ενώσεων, με δυνατότητα χρήσης ως εναλλακτικές λύσεις για τον έλεγχο παθογόνων στην υδατοκαλλιέργεια. Τα Tetraselmis red var., Pappas και A. gracilis, παρουσιάζουν ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι σημαντικών ιχθυοπαθογόνων βακτηρίων. Οι διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως η έκθεση σε διάφορα μήκη κύματος φωτός και η ηλιακή ακτινοβολία φαίνεται να ενισχύουν την ανασταλτική δράση. Η χημική ανάλυση αποκάλυψε την παρουσία λιπαρών οξέων, φλαβονοειδών και υδατανθράκων, επιβεβαιώνοντας τη σύνθετη φύση των μικροφυκών. Τα αποτελέσματα αποτελούν σημαντική πρόοδο στην κατανόηση των φυσικών αντιμικροβιακών μηχανισμών των μικροφυκών και προτείνουν βιώσιμες λύσεις για τη μείωση της χρήσης αντιβιοτικών στην υδατοκαλλιέργεια. Μελλοντική έρευνα θα πρέπει να επικεντρωθεί στην περαιτέρω απομόνωση και εμπορική αξιοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων αυτών των ειδών.