Ρύθμιση της ομοιόστασης σιδήρου στον αραβόσιτο

Abstract

Iron (Fe) is an essential micronutrient for plant growth and productivity, and plantbiomass constitutes a major dietary source of iron for both humans and animals. Despite theimportance of Fe and the extensive body of work on the mechanisms governing its uptake byplants, much less is known about the morphological and anatomical alterations that the rootsystem undergoes under conditions of insufficient Fe supply, or about the spatial organizationof Fe-deficiency responses along the root axis. Moreover, although maize is classicallydescribed as a Strategy II species in terms of iron acquisition, the presence of Strategy I-relatedgenes in its genome suggests that alternative Fe uptake mechanisms may also operate in thisspecies. Within this framework, this study focused on the regulation of iron homeostasis in maize(Zea mays L.), with particular emphasis on the morphological, physiological, and molecularresponses to Fe deficiency, as well as on the effect of gibberellins on the regulation of the -Feresponse. In parallel, the spatial organization of Fe acquisition and its regulation wasinvestigated at both the molecular and physiological levels along crown roots. Maize seedlingswere grown hydroponically under two distinct Fe nutritional regimes (Fe sufficiency orinsufficiency). In addition, plants were treated either with exogenous GA₃ or with mepiquatchloride, a gibberellin biosynthesis inhibitor. Samplings were carried out both short-term (2 daysafter treatment initiation) and long-term (7 days after treatment initiation). The analysesperformed included a comprehensive plant phenotyping, the quantification of Fe³⁺ depositionsand Fe²⁺ formation on the root surface, and the expression analysis of genes involved inphytosiderophore biosynthesis, Fe uptake, Fe storage, and the regulation of iron homeostasis. The experimental work was further complemented by a bioinformatic study aiming toinvestigate two maize genetic loci linking iron homeostasis and the root phenotype, as well asto identify novel candidate regulators of iron homeostasis and to detect cis-element motifs inthe promoters of selected genes of interest. As expected, the plant phenotype was strongly affected by Fe deficiency. A characteristic chlorosis, particularly in the younger leaves, was evident in the shoot, whilebiomass accumulation was also significantly reduced. In the root system, Fe deficiencyaffected both root length and root elongation rate and promoted the ectopic emergence oflateral roots in greater proximity to the root tip. In maize, this phenotype is referred to as BTR(Branching at the Terminal 5 centimeters of the Root) and has been associated with the geneticlocus “chrom7-glb1”. In addition, the locus “jpsb79-umc60” has been implicated in the reducedroot length observed under iron starvation. The in silico examination of these two loci pointed togibberellin signaling as a key link between the regulation of Fe homeostasis and themorphological and anatomical modifications which occur in the root under Fe deficiency. Inagreement, the exogenous application of GA₃ even in plants grown under iron sufficiencyinduced phenotypic and molecular changes resembling Fe deficiency, whereas inhibition ofgibberellin biosynthesis attenuated the severity of these phenotypes irrespectively of Fe supply.4Taken together, these findings strongly suggest that GA signaling is an integral component of theFe deficiency response in maize. At the physiological level, the response to iron deficiency was found to be differentiallyorganized in distinct root sectors. More specifically, responses occurring in the lateral rootsector primarily reflect the Fe status of the plant at the systemic level, whereas perturbations inthe root apex are strongly shaped by local Fe demands. Moreover, in addition to their effect onplant phenotype and physiology, gibberellins were also found to participate in the regulation ofStrategy II-mediated Fe acquisition, by repressing phytosiderophore biosynthesis and negativelyaffecting Fe translocation from root to shoot. This, in turn, leads to Fe accumulation in the rootsand the development of Fe deficiency in the shoot.Finally, the study provided important evidence for the existence of a functional ferrousiron uptake mechanism in maize, apparently operating in parallel with ferric iron acquisition viaStrategy II. The detection of Fe²⁺ formation at the root surface, together with the analysis of theferrous iron transporter paralogs ZmIRT1 and ZmIRT2, strengthens the view that iron uptake inmaize is more complex than previously thought and is not restricted to Strategy II alone. Overall, this study provides a comprehensive description of the -Fe phenotype in maizewhile also contributing to a more holistic understanding of iron acquisition mechanisms byexamining the organization of the -Fe response along different root sectors, as well as byproviding evidence of a ferric iron uptake pathway, operating in conjunction with Strategy II. It further demonstrates the involvement of gibberellins in the regulation of iron homeostasis atboth the phenotypic and molecular levels, while the bioinformatic analyses conducted identified novel regulators with putative roles in the iron homeostasis regulatory network.

Ο σίδηρος (Fe) είναι απαραίτητο ιχνοστοιχείο για την ομαλή ανάπτυξη καιπαραγωγικότητα των φυτών, ενώ η φυτική ύλη αποτελεί βασική πηγή για την κάλυψη τωναναγκών, τόσο του ανθρώπου όσο και των ζώων, σε σίδηρο. Ωστόσο, παρά τη σημαντικότητάτου και τον μεγάλο αριθμό μελετών που αφορούν στους μηχανισμούς πρόσληψής του από ταφυτά, πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τις μορφολογικές και ανατομικές μεταβολές πουυφίσταται το ριζικό σύστημα υπό συνθήκες ανεπαρκούς θρέψης με Fe, ή για την οργάνωση των-Fe αποκρίσεων κατά μήκος των ριζών. Ακόμα, παρότι ο αραβόσιτος περιγράφεται ως φυτό πουακολουθεί αποκλειστικά τη Στρατηγική ΙΙ για την πρόσληψη του σιδήρου, η παρουσία γονιδίωντης Στρατηγικής Ι στο γονιδίωμά του αφήνει ανοιχτό το ενδεχόμενο της ύπαρξης εναλλακτικώνμηχανισμών απορρόφησης σιδήρου. Έτσι, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στο πεδίο της ρύθμισης της ομοιόστασηςτου σιδήρου στον αραβόσιτο (Zea mays L.) που αφορά στις μορφολογικές, φυσιολογικές, καιμοριακές αποκρίσεις του φυτού στην έλλειψη του θρεπτικού αυτού, καθώς επίσης και στηνεπίδραση των γιββερελλινών στην εκδήλωση της -Fe απόκρισης. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στηνφαινοτυπική ανάλυση και τη μελέτη των μορφολογικών προσαρμογών του ριζικού συστήματοςστην έλλειψη σιδήρου, ενώ ακόμα διερευνήθηκε η χωρικότητα των -Fe αποκρίσεων σε μοριακόκαι φυσιολογικό επίπεδο κατά μήκος των βλαστογενών ριζών, ώστε να διαπιστωθεί αν ηαπόκριση στην έλλειψη Fe είναι ομοιόμορφη ή διαφέρει μεταξύ της περιοχής της ρίζας πουφέρει πλάγιες ρίζες και του ακρορριζίου. Για τον σκοπό αυτό, αρτίβλαστα αραβοσίτουαναπτύχθηκαν σε κατάλληλο υδροπονικό σύστημα σε δύο επίπεδα θρέψης με σίδηρο (επάρκειαή ανεπάρκεια Fe), ενώ επιπροσθέτως πραγματοποιήθηκαν χειρισμοί είτε με εφαρμογήεξωγενούς GA₃ είτε με προσθήκη του παρεμποδιστή της βιοσύνθεσης γιββερελλινών, mepiquatchloride. Δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν τόσο βραχυπρόθεσμα (2 ημέρες από την έναρξητων μεταχειρίσεων), όσο και μακροπρόθεσμα (7 ημέρες μετά την έναρξη των μεταχειρίσεων),στο πλαίσιο των οποίων διενεργήθηκαν μετρήσεις και προσδιορισμοί που αφορούσαν τονφαινότυπο του υπέργειου τμήματος και του ριζικού συστήματος, την ποσοτικοποίηση τωνεναποθέσεων Fe3+ και του σχηματισμού Fe2+ στην επιφάνεια των βλαστογενών ριζών, και τηνεξέταση της γονιδιακής έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεσηφυτοσιδηροφόρων, στην πρόσληψη Fe, στην αποθήκευση, και στη ρύθμιση της ομοιόστασηςτου σιδήρου. Η πειραματική διαδικασία πλαισιώθηκε από βιοπληροφορική ανάλυση για τημελέτη δύο γενετικών τόπων του αραβοσίτου που έχουν συσχετιστεί με τον φαινότυπο της ρίζαςκαι την ομοιόσταση του Fe, όπως επίσης και για την ανάδειξη νέων, υποψήφιων ρυθμιστών τηςομοιόστασης του σιδήρου, και για την ταυτοποίηση εγγύς στοιχείων (cis-elements) στουςυποκινητές των υπό εξέταση γονιδίων. Όπως αναμενόταν, η ανεπάρκεια σιδήρου επηρέασε δραστικά τον φαινότυπο τωνφυτών. Το υπέργειο μέρος παρουσίασε έντονη, χαρακτηριστική χλώρωση με έμφαση στανεότερα φύλλα, ενώ ακόμα παρατηρήθηκε μειωμένη συσσώρευση βιομάζας. Στο ριζικόσύστημα, η ανεπάρκεια Fe επηρέασε το μήκος και τον ρυθμό της επιμήκυνσης των ριζών, καιοδήγησε στην εμφάνιση πλάγιων ριζών σε μεγαλύτερη εγγύτητα προς το κορυφαίο μερίστωμα2της ρίζας, μειώνοντας έτσι σημαντικά το μήκος του ακρορριζίου. Ο φαινότυπος αυτός στοναραβόσιτο ονομάζεται BTR (Branching at the Terminal 5 centimeters of the Root) και έχεισυνδεθεί με τον γενετικό τόπο “chrom7-glb1”. Αντίστοιχα, ο γενετικός τόπος “jpsb79-umc60”εμπλέκεται στην εκδήλωση ενός άλλου -Fe φαινοτύπου της ρίζας, αυτόν της μείωσης του μήκουςτης. η βιοπληροφορική μελέτη των δύο αυτών γενετικών τόπων ανέδειξε τη σηματοδότηση τωνγιββερελλινών ως κόμβο μεταξύ της ρύθμισης της ομοιόστασης του Fe και τωνμορφοανατομικών μεταβολών που υφίσταται η ρίζα κατά την έλλειψη σιδήρου. Ως εκ τούτου, ηεξωγενής εφαρμογή GA₃, ακόμη και σε φυτά με επαρκή θρέψη με Fe, προκάλεσε φαινοτυπικέςκαι μοριακές μεταβολές που προσομοίαζαν εκείνες της σιδηροπενίας, ενώ η παρεμπόδιση τηςβιοσύνθεσης των γιββερελλινών περιόρισε την ένταση των αντίστοιχων φαινοτύπων, υπόέλλειψη σιδήρου. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι οι γιββερελλίνες αποτελούν ουσιώδεςτμήμα του μηχανισμού μέσω του οποίου ο αραβόσιτος αποκρίνεται στη μειωμένηδιαθεσιμότητα σιδήρου. Σε επίπεδο φυσιολογίας, προέκυψε ότι η απόκριση στην ανεπάρκεια σιδήρου εμφανίζεισαφή χωρική οργάνωση κατά μήκος της ρίζας. Πιο συγκεκριμένα, οι αποκρίσεις της περιοχήςτης ρίζας που φέρει πλάγιες ρίζες φαίνεται να αντανακλούν πρωτίστως τη θρεπτική κατάστασηολόκληρου του φυτού ως σύστημα, ενώ οι μεταβολές στο ακρορρίζιο διαμορφώνονταιπερισσότερο από τις τοπικές απαιτήσεις για Fe, και οι οποίες σε μεγάλο βαθμό απορρέουν απότον μεταβολισμό του ακρορριζίου και την ανάπτυξη της ρίζας. Παράλληλα, πέραν τουφαινοτύπου και της φυσιολογίας του φυτού διαπιστώθηκε ότι οι γιββερελλίνες εμπλέκονται στηρύθμιση της πρόσληψης σιδήρου μέσω της Στρατηγικής ΙΙ, καταστέλλοντας τη βιοσύνθεσηφυτοσιδηροφόρων και επηρεάζοντας αρνητικά τη μεταφορά του Fe από τη ρίζα προς τουπέργειο μέρος, γεγονός που οδηγεί στη συσσώρευσή του στις ρίζες και στην ταυτόχρονηεκδήλωση ανεπάρκειας σιδήρου στον βλαστό. Τέλος, προέκυψαν σημαντικές ενδείξεις για την ύπαρξη λειτουργικού μηχανισμούαπορρόφησης δισθενούς σιδήρου στον αραβόσιτο, ο οποίος φαίνεται να ενεργεί παράλληλα μετην πρόσληψη τρισθενούς σιδήρου μέσω της Στρατηγικής II. Η διαπίστωση του σχηματισμούFe2+ στην επιφάνεια της ρίζας, σε συνδυασμό με τη μελέτη των παραλόγων μεταφορέωνδισθενούς σιδήρου ZmIRT1 και ZmIRT2, ενισχύει την άποψη ότι η πρόσληψη σιδήρου στοναραβόσιτο είναι πιο περίπλοκη απ’ ότι θεωρούνταν και δεν περιορίζεται μόνο στη Στρατηγική ΙΙ. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει μια διεξοδική περιγραφή του -Fe φαινοτύπουστον αραβόσιτο, ενώ συμβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση των μηχανισμών πρόσληψηςσιδήρου μέσω της αποσαφήνισης της οργάνωσης της -Fe απόκρισης κατά μήκος της ρίζας,καθώς και της ανάδειξης εναλλακτικής οδού απορρόφησης Fe2+. Ακόμα, καταδεικνύει τονσημαντικό ρόλο των γιββερελλινών στη ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου, τόσο σεφαινοτυπικό, όσο και σε μοριακό επίπεδο, ενώ η βιοπληροφορική ανάλυση που διενεργήθηκεταυτοποίησε νέους ρυθμιστές με ενδεχόμενη εμπλοκή στο δίκτυο ρύθμισης της ομοιόστασηςFe.