Discovery of new pharmaceutical approaches using protein interaction networks, molecular modelling and organic spectroscopy

Abstract

This thesis leverages advanced computational methodologies to predict and characterize the host–gut microbiome interplay through a structural lens, thereby addressing the inherent limitations of experimental interactomics and the scarcity of high-resolution structural data. The research is organized around three primary pillars: the development of predictive models, the biological characterization of the predicted interactome, and the translation of these findings into therapeutic insights. The first phase of this work focuses on deciphering the molecular interplay between the microbial and host proteomes. Initial efforts involved the construction of a protein–protein interaction network (PPIN) using machine learning (ML) to extract statistically significant associations between Pfam domains. This model was trained on a large-scale, heterogeneous dataset comprising over one million experimentally validated interactions across multiple taxa. To enhance predictive fidelity, a novel hybrid deep learning (DL) architecture was subsequently developed. This framework integrates graph-based protein representations with Variational Autoencoders (VAEs) to generate latent structural embeddings, which are then processed by a bi-directional cross-attention module to predict interactions. To ensure robustness against class imbalance, the model employs a focal loss that prioritizes hard-to-classify samples. The second objective involves the systematic biological and topological analysis of the predicted PPIN in order to identify disease associations. Through multi-parametric topological evaluations—including degree distributions, assortativity, and mean degree–abundance correlations—the study characterizes the resilience and organizational logic of the host–microbe interactome. This analysis identified critical protein hubs implicated in inflammation, cancer, mitochondrial dysfunction, and cardiometabolic disorders. The final phase translates these computational findings into pharmacological insights. Focusing on the identified hubs, the study employed an orthological design strategy to develop small organic molecules targeting pathological interactions in obesity- and cardiometabolic-related pathways. Given the strong association uncovered between the interactome and colorectal cancer (CRC), the DL model was further applied to clinical metagenomic data to distinguish the molecular signatures of healthy individuals from those of CRC patients. Centrality analysis identified key host proteins, which were then targeted for the rational repurposing of natural products. Achillea millefolium was identified as a primary candidate, and molecular docking together with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were subsequently employed to validate the binding affinity of its synthetic compounds against the identified host targets. Overall, this thesis integrates computational modeling, structural biology, and clinical systems data to advance the understanding of the gut microbiome's influence on human health. By establishing a multi-scale pipeline—spanning from deep learning–based prediction to experimental validation—this work provides a foundational framework for discovering therapeutic targets and for elucidating the molecular mechanisms that underlie host–microbe cross-talk in both physiological and pathological states.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιεί προηγμένες υπολογιστικές μεθοδολογίες για την πρόβλεψη και τον χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ του ξενιστή και του μικροβιώματος του εντέρου υπό ένα δομικό πρίσμα, αντιμετωπίζοντας έτσι τους εγγενείς περιορισμούς της πειραματικής διερεύνησης των πρωτεϊνικών αυτών αλληλεπιδράσεων και τη σπανιότητα δεδομένων δομής υψηλής ευκρίνειας. Η έρευνα διαρθρώνεται γύρω από τρεις βασικούς πυλώνες: την ανάπτυξη προβλεπτικών μοντέλων, τον βιολογικό χαρακτηρισμό του προβλεπόμενου συνόλου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και τη μετάφραση των ευρημάτων αυτών σε θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η πρώτη φάση της εργασίας επικεντρώνεται στην αποσαφήνιση της μοριακής αλληλεπίδρασης μεταξύ του μικροβιακού και του ανθρώπινου πρωτεώματος. Οι αρχικές προσπάθειες περιλάμβαναν την κατασκευή ενός δικτύου αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης–πρωτεΐνης (Protein-protein interaction network, PPIN) με χρήση μηχανικής μάθησης ( Machine Learning, ML) για την εξαγωγή στατιστικά σημαντικών συσχετίσεων μεταξύ των περιοχών Pfam. Το μοντέλο αυτό εκπαιδεύτηκε σε ένα ευρείας κλίμακας, ετερογενές σύνολο δεδομένων που περιλάμβανε περισσότερο από ένα εκατομμύριο πειραματικά επιβεβαιωμένες αλληλεπιδράσεις από πολλαπλά taxa. Για την ενίσχυση της προβλεπτικής ακρίβειας, αναπτύχθηκε στη συνέχεια μια νέα υβριδική αρχιτεκτονική βαθιάς μάθησης (Deep Learning, DL). Το πλαίσιο αυτό ενσωματώνει αναπαραστάσεις πρωτεϊνών βασισμένες σε γράφους μαζί με παραλλακτικούς αυτοκωδικοποιητές (Variational Autoencoders, VAEs) για τη δημιουργία λανθανουσών δομικών ενσωματώσεων (Latent embeddings), οι οποίες κατόπιν επεξεργάζονται από ένα αμφίδρομο δομοστοιχείο διασταυρούμενης προσοχής (Bi-directional cross-attention) για την πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων. Για τη διασφάλιση της ευρωστίας έναντι της ανισορροπίας των κλάσεων, το μοντέλο χρησιμοποιεί συνάρτηση εστιακής απώλειας (Focal loss) που δίνει προτεραιότητα στα δυσκολότερα ταξινομήσιμα δείγματα.Ο δεύτερος στόχος αφορά τη συστηματική βιολογική και τοπολογική ανάλυση του προβλεπόμενου PPIN με σκοπό τον εντοπισμό συσχετίσεων με νόσους. Μέσω πολυπαραμετρικών τοπολογικών αξιολογήσεων—που περιλαμβάνουν κατανομές βαθμού (Degree distributions), συναρμοστικότητα (Assortativity) και συσχετίσεις μέσου βαθμού–αφθονίας—η μελέτη χαρακτηρίζει την ανθεκτικότητα και την οργανωτική λογική του διαδραστικώματος ξενιστή–μικροβίου. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε κρίσιμους πρωτεϊνικούς κόμβους (Hubs) που εμπλέκονται στη φλεγμονή, τον καρκίνο, τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και τις καρδιομεταβολικές διαταραχές. Η τελική φάση μεταφράζει τα υπολογιστικά αυτά ευρήματα σε φαρμακολογικές προσεγγίσεις. Εστιάζοντας στους κόμβους που εντοπίστηκαν, η μελέτη εφάρμοσε μια στρατηγική ορθολογικού σχεδιασμού για την ανάπτυξη μικρών οργανικών μορίων που στοχεύουν παθολογικές αλληλεπιδράσεις σε οδούς σχετιζόμενες με την παχυσαρκία και τις καρδιομεταβολικές διαταραχές. Δεδομένης της ισχυρής συσχέτισης που αποκαλύφθηκε μεταξύ των αλληεπιδράσεων βακτηριών-ανθρώπου και του καρκίνου του παχέος εντέρου, το μοντέλο DL εφαρμόστηκε περαιτέρω σε κλινικά μεταγονιδιωματικά δεδομένα για τη διάκριση των μοριακών υπογραφών υγιών ατόμων από εκείνες ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου. Η ανάλυση κεντρικότητας ανέδειξε καίριες πρωτεΐνες του ξενιστή, οι οποίες στη συνέχεια αποτέλεσαν στόχους για την ορθολογική επαναστόχευση φυσικών προϊόντων. Το φυτό Achillea millefolium αναγνωρίστηκε ως πρωταρχικός υποψήφιος, και ακολούθως χρησιμοποιήθηκαν μοριακή πρόσδεση (Molecular docking) σε συνδυασμό με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) για την επικύρωση της συγγένειας πρόσδεσης συνθετικών μορίων ως προς τους στόχους του ξενιστή που εντοπίστηκαν. Συνολικά, η παρούσα διατριβή ενοποιεί την υπολογιστική μοντελοποίηση, τη δομική βιολογία και τα κλινικά δεδομένα συστημικής βιολογίας, ώστε να προαγάγει την κατανόηση της επίδρασης του μικροβιώματος του εντέρου στην ανθρώπινη υγεία. Μέσω της δημιουργίας ενός πολυκλιμακωτού υπολογιστικού αγωγού (Pipeline)—που εκτείνεται από την πρόβλεψη βασισμένη σε βαθιά μάθηση έως την πειραματική επικύρωση—η εργασία αυτή παρέχει ένα θεμελιώδες πλαίσιο για την ανακάλυψη θεραπευτικών στόχων και την αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την επικοινωνία ξενιστή–μικροβίου τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις.