Μελέτη της επίδρασης των TLRs και της ενεργοποίησης του PD-1 στην ένταση και την αποτελεσματικότητας της ανοσοαπάντησης σε πειραματικό πρότυπο ενδοκοιλιακής σήψης σε επιμύες

Abstract

Summary Introduction: Sepsis is one of the leading causes of mortality among hospitalized patients. The underlying pathophysiological mechanisms of sepsis have not yet been fully elucidated. The programmed cell death protein 1 (PD-1) receptor and its ligand (PD-L1), in conjunction with Toll-like receptors (TLRs), appear to play a pivotal role in systemic responses during sepsis. Investigating their interaction and identifying potential molecular target pathways seem to be of particular importance and may represent a future avenue for the management of sepsis, especially in relation to acute lung injury. Objective: The aim of this experiment is to demonstrate the interaction of specific TLRs with the cellular expression of PD-1 and/or its ligand, as well as their relationship with survival, immune competence, and cytokine expression. Study design: Prospective, randomized, controlled interventional study. Setting: Center for Clinical, Experimental Surgery and Translational Research, Biomedical Research Foundation of the Academy of Athens, Greece. Subjects: Male C57BL/6J mice aged 16 to 20 weeks. Methods: The present study investigated the interactions between TLR-5, TLR-6, and TLR-9 and the expression of PD-1/PD-L1 in an experimental mouse model of sepsis. A total of sixty C57BL/6J mice were included and allocated into six experimental groups: three sepsis (S) groups (24 h, 48 h, and 72 h) and three sham (Sh) groups (24 h, 48 h, and 72 h). Sepsis in the S groups was induced using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Hematological analyses and histopathological examination of lung tissue were performed at 24, 48, and 72 hours. Results: Statistically significant decreases in white blood cell (WBC) and lymphocyte counts were observed in the sepsis groups compared to the sham groups at all time points (24, 48, and 72 hours). In contrast, significant increases were recorded in red blood cell (RBC) and monocyte counts, as well as in the levels of cytokines IL-6 and IL10. Histopathological analysis also revealed increased alveolar flooding and alveolar collapse. In the control groups (Sh24, Sh48, Sh72), the expression of TLR-5, TLR-6, and TLR-9, as well as PD-1 and PD-L1, remained at baseline levels, with no significant differences observed among the time points. In contrast, in the sepsis groups, a significant timedependent increase in the expression of all examined molecules was observed. Specifically, in the S24 group, early activation of the immune response was recorded. At this stage, an increase in the expression of TLR-5 and TLR-6 was observed, which was evident but not markedly differentiated across subsequent time points. TLR-9 exhibited a significant increase in expression as early as 24 hours, indicating its early involvement in the recognition of microbial components and the initiation of the inflammatory response. Concurrently, increased expression of PD-1 and PD-L1 was observed in the same group, suggesting that the activation of immunosuppressive mechanisms begins already at the early stages of sepsis. At the level of correlations, in the S24 group, PD-1 showed a significant positive correlation with PD-L1 and IRAK1, while PD-L1 was correlated with MYD88 and IRAK1, indicating that the crosstalk between TLR signaling pathways and the PD-1/PD-L1 axis is already activated at the early stage. In the S48 group, which represents the peak phase of the inflammatory response, a further increase in PD-1 expression was observed, higher than in the S24 group, along with a continuous increase in PD-L1 expression. The peak of PD-1 expression at 48 hours suggests strong activation of the immunosuppressive axis at this time point. Regarding TLRs, TLR-5 and TLR-6 did not show a significant further increase, suggesting that their activity is mainly confined to the early stages. In contrast, TLR-9 continued to increase, demonstrating a clear dynamic upregulation. At the level of molecular correlations, in the S48 group, PD-1 was significantly correlated with PD-L1, MYD88,and IRAK1, confirming the role of MyD88 as a central mediator. Additionally, TLR-9 showed a positive correlation with NF-κB and a negative correlation with TLR-6, indicating divergence among the signaling pathways of individual TLRs. In the S72 group, representing the late stages of sepsis and established immunosuppression, the highest overall expression of PD-L1 was observed, along with a continued increase in PD-1 expression. This pronounced overexpression is associated with the establishment of immunoparalysis and functional exhaustion of T lymphocytes. TLR-9 also reached its maximum expression in this group, suggesting its involvement both in the maintenance of inflammation and in the progression of tissue damage. In contrast, TLR-5 and TLR-6 remained at relatively stable levels compared to earlier time points. Of particular interest are the correlations observed in the S72 group, where PD-L1 was significantly correlated with TLR-6 and MYD88, while TLR-6 was also correlated with MYD88. This association highlights TLR-6 as a potential critical link between TLR activation and the induction of the PD-1/PD-L1 axis at the late stages of sepsis. Furthermore, TLR-9 showed a correlation with TIRAP, reinforcing its role in sustaining signaling through adaptor molecules. Overall, the findings of the study demonstrate that TLR-5, TLR-6, and TLR-9 are activated during sepsis with distinct temporal dynamics, with TLR-5 and TLR-6 primarily involved in the early stages and TLR-9 maintaining progressively increasing expression throughout the course of the disease. In parallel, the PD-1/PD-L1 axis is activated already at early stages, with peak and sustained expression at later stages, suggesting a progressive enhancement of immunosuppression. The correlations of PD-1 and PD-L1 with MYD88 and IRAK1 at multiple time points, as well as the specific correlation of PD-L1 with TLR-6 at late stages, support the hypothesis that TLR signaling, via the MyD88 pathway, directly contributes to the induction of the immunosuppressive axis. In conclusion, the present study suggests that the interplay between TLRs and the PD1/PD-L1 axis constitutes a central pathophysiological mechanism in sepsis, regulating the transition from inflammation to immunosuppression. In particular, TLR-6 appears to play a pivotal role in linking these two systems, while TLR-9 primarily contributes to the maintenance of the inflammatory process. Understanding these mechanisms may provide a basis for the development of novel therapeutic strategies targeting both the inflammatory and immunosuppressive components of sepsis.

Περίληψη Εισαγωγή: Παρά τις εξελίξεις στη σύγχρονη εντατική θεραπεία, η σήψη εξακολουθεί να σχετίζεται με σημαντικά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Οι υποκείμενοι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί της σήψης δεν έχουν ακόμη πλήρως αποσαφηνιστεί. Ο υποδοχέας του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου 1 (PD-1) και ο συνδέτης του (PD-L1), σε συνδυασμό με τους υποδοχείς τύπου Toll (TLRs), φαίνεται ότι διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις συστηματικές αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της σήψης. Η διερεύνηση της μεταξύ τους αλληλεπίδρασης και ο εντοπισμός δυνητικών μοριακών οδών-στόχων, φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικά, και ίσως ένας δρόμος για τη μελλοντική αντιμετώπιση της σήψης, ιδίως σε σχέση με την οξεία πνευμονική βλάβη. Σκοπός: Σκοπός του πειράματος είναι να διερευνηθεί η αλληλοεπίδραση συγκεκριμένων TLRs με την κυτταρική έκφραση του PD-1 ή και του συνδέτη του, την ανοσοεπάρκεια και την έκφραση κυτταροκινών. Πειραματικός σχεδιασμός: Προοπτική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη παρέμβασης. Τοποθεσία: Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών. Πειραματόζωα: Άρρενες μύες C57BL/6J ηλικίας 16 έως 20 εβδομάδων Μέθοδος: Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των TLR-5, TLR-6 και TLR-9 και της έκφρασης των PD-1/PD-L1 σε πειραματικό μοντέλο σήψης σε ποντίκια. Συνολικά, συμπεριλήφθηκαν εξήντα ποντίκια στελέχους C57BL/6J, τα οποία κατανεμήθηκαν σε έξι πειραματικές ομάδες: τρεις ομάδες σήψης (S) (24, 48 και 72 ώρες) και τρεις ομάδες ελέγχου (Sh) (24, 48 και 72 ώρες). Η χρονική αυτή διαστρωμάτωση επέτρεψε την αξιολόγηση της δυναμικής εξέλιξης της φλεγμονώδους και ανοσοκατασταλτικής απόκρισης. Η σήψη στις ομάδες S προκλήθηκε με τη μέθοδο της απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού (cecal ligation and puncture, CLP). Μετά από 24, 48 και 72 ώρες πραγματοποιήθηκαν αιματολογικές εξετάσεις και ιστοπαθολογική ανάλυση του πνευμονικού ιστού. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές μειώσεις στον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) και των λεμφοκυττάρων στις ομάδες σήψης σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου σε όλα τα χρονικά σημεία (24, 48 και 72 ώρες). Αντιθέτως, καταγράφηκαν σημαντικές αυξήσεις στον αριθμό των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) και των μονοκυττάρων, καθώς και στα επίπεδα των κυτταροκινών IL-6 και IL-10. Η ιστοπαθολογική εξέταση ανέδειξε επίσης αυξημένη κυψελιδική πλήρωση (alveolar flooding) και σύμπτωση των κυψελίδων (alveolar collapse). Στις ομάδες ελέγχου (Sh24, Sh48, Sh72), η έκφραση των TLR-5, TLR-6 και TLR-9, καθώς και των PD-1 και PD-L1, παρέμεινε σε βασικά επίπεδα, χωρίς σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των χρονικών σημείων. Αντίθετα, στις ομάδες σήψης παρατηρήθηκε σημαντική χρονικά εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης όλων των εξεταζόμενων μορίων. Ειδικότερα, στην ομάδα S24 καταγράφηκε η πρώιμη ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης. Σε αυτό το στάδιο παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των TLR-5 και TLR-6, η οποία ήταν εμφανής αλλά όχι έντονα διαφοροποιημένη μεταξύ των επόμενων χρονικών σημείων. Ο TLR-9 παρουσίασε ήδη από τις 24 ώρες σημαντική αύξηση της έκφρασής του, υποδεικνύοντας την πρώιμη συμμετοχή του στην αναγνώριση μικροβιακών μορίων και στην έναρξη της φλεγμονώδους αντίδρασης. Παράλληλα, στην ίδια ομάδα παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του PD-1 και του PD-L1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση των ανοσοκατασταλτικών μηχανισμών ξεκινά ήδη από τα πρώιμα στάδια της σήψης. Στο επίπεδο των συσχετίσεων, στην ομάδα S24 ο PD-1 εμφάνισε σημαντική θετική συσχέτιση με τον PD-L1 και τον IRAK1, ενώ ο PD-L1 συσχετίστηκε με την MYD88 και τον IRAK1, υποδηλώνοντας ότι ήδη από το πρώιμο στάδιο ενεργοποιείται η διασύνδεση μεταξύ των TLR σηματοδοτικών οδών και του άξονα PD-1/PD-L1.Στην ομάδα S48, η οποία αντιπροσωπεύει τη φάση κορύφωσης της φλεγμονώδους απόκρισης, παρατηρήθηκε περαιτέρω αύξηση της έκφρασης του PD-1, η οποία ήταν υψηλότερη σε σύγκριση με την ομάδα S24, καθώς και συνεχής αύξηση της έκφρασης του PD-L1. Η κορύφωση της έκφρασης του PD-1 στις 48 ώρες υποδηλώνει έντονη ενεργοποίηση του ανοσοκατασταλτικού άξονα σε αυτή τη χρονική φάση. Όσον αφορά τους TLRs, οι TLR-5 και TLR-6 δεν παρουσίασαν σημαντική περαιτέρω αύξηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δράση τους εντοπίζεται κυρίως στα πρώιμα στάδια. Αντίθετα, ο TLR-9 συνέχισε να αυξάνεται, παρουσιάζοντας σαφή δυναμική ενίσχυσης. Σε επίπεδο μοριακών συσχετίσεων, στην ομάδα S48 ο PD-1 συσχετίστηκε σημαντικά με τον PD-L1, την MYD88 και τον IRAK1, υποδηλώνοντας τον ρόλο της MyD88 ως κεντρικού διαμεσολαβητή. Παράλληλα, ο TLR-9 εμφάνισε θετική συσχέτιση με τον NF-κB και αρνητική με τον TLR-6, υποδηλώνοντας διαφοροποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών μεταξύ των επιμέρους TLRs. Στην ομάδα S72, που αντιπροσωπεύει τα όψιμα στάδια της σήψης και την εγκατεστημένη ανοσοκαταστολή, παρατηρήθηκε η υψηλότερη συνολικά έκφραση του PD-L1, με συνεχιζόμενη αύξηση και του PD-1. Η έντονη αυτή υπερέκφραση συνδέεται με την εγκατάσταση της ανοσοπαράλυσης και τη λειτουργική εξάντληση των Τ-λεμφοκυττάρων. Ο TLR-9 παρουσίασε επίσης τη μέγιστη έκφρασή του στην ομάδα αυτή, γεγονός που υποδηλώνει ότι συμμετέχει τόσο στη διατήρηση της φλεγμονής όσο και στην εξέλιξη της ιστικής βλάβης. Αντίθετα, οι TLR-5 και TLR-6 παρέμειναν σε σχετικά σταθερά επίπεδα σε σχέση με τα προηγούμενα χρονικά σημεία. Ιδιαίτερη σημασία παρουσιάζουν οι συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν στην ομάδα S72, όπου ο PD-L1 συσχετίστηκε σημαντικά με τον TLR-6 και την MyD88, ενώ ο TLR-6 συσχετίστηκε επίσης με την MyD88. Η συσχέτιση αυτή αναδεικνύει τον TLR6 ως πιθανό κρίσιμο σύνδεσμο μεταξύ της ενεργοποίησης των TLRs και της επαγωγής του άξονα PD-1/PD-L1 στα όψιμα στάδια της σήψης. Επιπλέον, ο TLR-9 εμφάνισε συσχέτιση με το TIRAP, ενισχύοντας τον ρόλο του στη διατήρηση της σηματοδότησης μέσω των προσαρμοστικών μορίων. Συνολικά, τα ευρήματα της μελέτης καταδεικνύουν ότι οι TLR-5, TLR-6 και TLR-9 ενεργοποιούνται κατά τη σήψη με διακριτή χρονική δυναμική, με τους TLR-5 και TLR6 να συμμετέχουν κυρίως στα πρώιμα στάδια και τον TLR-9 να διατηρεί αυξανόμενη έκφραση σε όλη τη διάρκεια της νόσου. Παράλληλα, ο άξονας PD-1/PD-L1 ενεργοποιείται ήδη από τα πρώιμα στάδια, με κορύφωση και διατήρηση της έκφρασής του στα όψιμα στάδια, γεγονός που υποδηλώνει προοδευτική ενίσχυση της ανοσοκαταστολής. Η συσχέτιση του PD-1 και του PD-L1 με την MyD88 και τον IRAK1 σε πολλαπλά χρονικά σημεία, καθώς και η ειδική συσχέτιση του PD-L1 με τον TLR-6 στα όψιμα στάδια, υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η σηματοδότηση των TLRs, μέσω της οδού MyD88, συμβάλλει άμεσα στην επαγωγή του ανοσοκατασταλτικού άξονα. Καταληκτικά, η παρούσα μελέτη υποδεικνύει ότι η διασύνδεση μεταξύ των TLRs και του άξονα PD-1/PD-L1 αποτελεί κεντρικό παθοφυσιολογικό μηχανισμό στη σήψη, ο οποίος ρυθμίζει τη μετάβαση από τη φλεγμονή στην ανοσοκαταστολή. Ιδιαίτερα, ο TLR-6 φαίνεται να διαδραματίζει κομβικό ρόλο στη σύνδεση των δύο αυτών συστημάτων, ενώ ο TLR-9 φαίνεται να συμβάλλει κυρίως στη διατήρηση της φλεγμονώδους διεργασίας. Η κατανόηση των μηχανισμών αυτών μπορεί να αποτελέσει τη βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών που θα στοχεύουν συνδυαστικά τόσο τη φλεγμονώδη όσο και την ανοσοκατασταλτική συνιστώσα της σήψης.