Development of tailor-made natural Deep Eutectic Solvents and sustainable systems for bioactive compound recovery from Alkanna tinctoria (L.) Tausch: scondrary metabolite production of co-cultures with bacterial endophytes of the Boraginaceae family

Abstract

Medicinal plants represent a rich source of bioactive compounds, namely primary and secondary metabolites (e.g. PMs and SMs), and have been widely used for their therapeutic properties since ancient times. In recent years, there has been a growing interest in expanding the range of pharmaceutical applications of SMs. As natural products represent a huge structural and functional diversity, nowadays SMs have become well established active ingredients beyond pharmaceuticals, in the field of cosmetics and food supplements. This continuous increasing demand of plant-based products lead to the investigation of modern and large-scale techniques for producing higher quantities of bioactive compounds from medicinal plants. The production of SMs in the plants and thus, plant metabolome, are highly affected according to environmental conditions and cultivation regime, that can hinder their commercial exploitation. Among the different plant families recorded, Boraginaceae family is known from Paleocene and presents an important worldwide distribution of different plants species, mainly in Europe and Asia, in the Northern hemisphere. The family is composed from more than a hundred of different genera and more than 2000 plant species are recognized, among which the well-known Myosotis, Lithospermum, Alkanna and Anchusa spp. The different species are well documented for their therapeutic proprieties attributed to their SM content such as flavonoids, phenylpropanoids, saponins or naphtoquinones (e.g. cardiotonic, antimicrobial, antipyretic, and anti-asthmatic). Among the most relevant compounds of the family are the lipophilic isohexenylnaphthazarins derivatives, Alkannin and Shikonin, known as red dyes sources with a plethora of biological properties (e.g. wound healing, antimicrobial, anti-inflammatory). In the current thesis, we dedicated our research on Alkanna tinctoria (L.) Tausch due to their wide distribution in the Mediterranean basin, especially in Greece, and to the beneficial properties attributed to this plant species reported in the literature. To this end, in the three first chapters of the current study, we investigated emerging extraction methods as natural deep eutectic solvents (NaDES) to improve yield and reduce solvent dependency. In Chapter I, an extensive screening of natural deep eutectic solvents (NaDESs) was conducted for the selective extraction of hydroxynaphthoquinone enantiomers (HNQs) from the roots of Alkanna tinctoria (L.) Tausch, a Mediterranean-native species known for its pharmaceutical and cosmeceutical applications. Over sixty tailor-made NaDESs were evaluated, focusing on the influence of intrinsic physicochemical properties on extraction efficiency and enantiomeric specificity. Multivariate analysis and one-factor-at-a-time optimization identified an eutectic mixture composed of levulinic acid and glucose (LeG) in a 5:1 molar ratio with 20% water (w/w) as the most effective solvent for HNQ extraction. Further process optimization using response surface methodology revealed that a temperature of 45 °C, a solid-to-liquid ratio of 30 mg/mL, and an extraction time of 50 minutes maximized HNQ yield to 41.72 ± 1.04 mg/g, comparable to conventional organic solvents. The findings of the current study pointed out NaDESs as a versatile and eco-friendly alternative for efficient and sustainable HNQs extraction. In Chapter II, we moved our efforts forward and proposed recovery methods for HNQs from Alkanna tinctoria (L.) Tausch roots extract realized with LeG NaDES, including solid phase extraction, macroporous resin, and water as an anti-solvent. Comparison analysis were conducted to address the key limitation of NaDES: its non-evaporative nature. Among the tested methods, solid-phase extraction on a reversed-phase C8 cartridge achieved the highest hydroxynaphthoquinone content (TNC) of 46.79 ± 0.952 mg/g DW. Macroporous resin Amberlite XAD 4 also demonstrated high recovery potential, with a TNC of 37.21 ± 1.789 mg/g DW, and precipitation using water as an anti-solvent yielded a TNC of 28.68 ± 0.023 mg/g DW. Furthermore, the scale-up process using Amberlite XAD 4 showcased robust recovery efficiency (34.126 ± 1.093 mg/g DW, RSD < 15%) and enabled the recycling of LeG_5_20 with over 50% recovery. This study highlights Amberlite XAD 4 as a promising solution for industrial applications and positions the NaDES-based extraction system as an excellent eco-friendly alternative for HNQ recovery. In Chapter III, it was of extreme importance to shed light on the environmental and health impacts of the extraction process developed using NaDES, to answer the following question: is it enough to use LeG_5_20 NaDES to “green” the extraction process of HNQs from Alkanna tinctoria (L.) Tausch roots? For this reason, a new and a comprehensive tool, the Green Extraction Process Index (GEPI), was developed for evaluating the greenness of an entire extraction procedure. Inspired by the Analytical Eco-Scale and Green Analytical Procedure Index (GAPI), GEPI uses pictograms with a color-coded scale (green, yellow, red) to classify the environmental and human health impacts of each stage, from raw material sourcing to waste treatment. In this study, GEPI was applied to compare the conventional petroleum-based extraction of hydroxynaphthoquinone enantiomers (HNQs) from Alkanna tinctoria (L.) Tausch roots with a new green alternative using a natural deep eutectic solvent (NaDES). The analysis confirmed that NaDES, specifically LeG_5_20, significantly improved the greenness of the extraction process, offering undeniable benefits in throughput and performance. However, GEPI also emphasized the importance of considering the entire extraction procedure, highlighting concerns around raw material sourcing, pre-treatment, and post-extraction treatment, thereby providing a holistic evaluation of the green character of extraction methods. In addition to developing a green extraction and recovery method for HNQs from Alkanna tinctoria (L.) Tausch roots, exploring soilless and biotechnological cultivation advancements can enhance sustainability and efficiency, maximizing the use of the plant's valuable bioactive compounds while avoiding the massive utilization of natural sources often resulting in the exhaustion of wild plants. In that regard, in Chapter IV, we advanced our initiatives and introduced a novel approach for the sustainable cultivation and extraction of bioactive compounds from Alkanna tinctoria (L.) Tausch roots, focusing on hydroxynaphthoquinone enantiomers (HNQs), which are renowned for their pharmaceutical and cosmeceutical applications. Utilizing a hydroponic nutrient film technique (NFT), the research successfully established an ex-situ cultivation system demonstrating promising plant acclimatization, growth, and root biomass production. Additionally, the study evaluated a natural deep eutectic solvent (NaDES), specifically a levulinic acid-glucose mixture (LeG_5_20), as a green extraction alternative. Preliminary toxicity assessments indicated that short-term NaDES exposure caused minimal stress to plants, though prolonged exposure revealed significant impacts. The integration of hydroponic systems with NaDES extraction offers a sustainable, non-destructive method for bioactive compound recovery, paving the way for environmentally friendly solutions in natural product extraction and conservation efforts. Future research will focus on optimizing extraction conditions and utilizing mature plant material to maximize HNQ production and recovery. Besides the development of a hydroponic nutrient film culture, it was essential to explore in vitro cells culture of Alkanna tinctoria (L.) Tausch and the elicitation by her endophyte’s bacteria, previously isolated. For this reason, in Chapter V, an untargeted metabolomic approach using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS) combined with multivariate data analysis was employed to investigate the interaction between Alkanna tinctoria (L.) Tausch cell suspension cultures and eight bacterial endophytes. The impact of bacterial endophytes on secondary metabolite (SM) production was assessed using principal component analysis and hierarchical clustering, revealing significant modifications in the metabolome. A total of several dimer and tetramer compounds (e.g., 8’-decarboxy-rosmarinic acid, 8’’’decarboxy-salvanolic B, 8’’-8’’’-didecarboxy-salvianolic acid B) and 3’-hydroxy-14 hydroxyshikonofuran H were putatively identified for the first time in Alkanna tinctoria (L.) Tausch. Our findings demonstrated how specific biosynthetic pathways in secondary metabolite production are influenced by endophyte interaction under controlled in vitro cultivation systems. The study provides new insights into the potential application of microbial inoculants to enhance the production of high-value phytochemicals in plants. To conclude, our efforts were mainly concentrated in developing an extraction method for the recovery of high valuable compounds, HNQs, from the medicinal plant, Alkanna tinctoria (L.) Tausch. Secondly, we focused on a strong metabolic workflow combined with multivariate data analysis which can be easily applied for the evaluation of Alkanna tinctoria (L.) Tausch in vitro cells-endophytic bacteria association for the enhancement of HNQs

Τα φαρμακευτικά φυτά αποτελούν μια πλούσια πηγή βιοδραστικών ενώσεων, δηλαδή πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών και χρησιμοποιούνται ευρέως για τις θεραπευτικές τους ιδιότητες ήδη από την αρχαιότητα. Τα τελευταία χρόνια, παρατηρείται αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη διεύρυνση του φάσματος των φαρμακευτικών εφαρμογών των δευτερογενών μεταβολιτών. Καθώς τα φυσικά προϊόντα παρουσιάζουν τεράστια δομική και λειτουργική ποικιλομορφία, οι δευτερογενείς μεταβολίτες έχουν πλέον καθιερωθεί ως δραστικά συστατικά όχι μόνο στα φαρμακευτικά προϊόντα αλλά και στους τομείς των καλλυντικών και των συμπληρωμάτων διατροφής. Η συνεχώς αυξανόμενη ζήτηση για φυτικά προϊόντα οδήγησε στη διερεύνηση σύγχρονων και μεγάλης κλίμακας τεχνικών για την παραγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων βιοδραστικών ενώσεων από φαρμακευτικά φυτά. Η παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών στα φυτά, επηρεάζονται σημαντικά από τις περιβαλλοντικές συνθήκες και το καλλιεργητικό καθεστώς, γεγονός που μπορεί να περιορίσει την εμπορική τους αξιοποίηση. Μεταξύ των διαφόρων φυτικών οικογενειών που έχουν καταγραφεί, η οικογένεια Boraginaceae είναι γνωστή ήδη από το Παλαιόκαινο και παρουσιάζει σημαντική παγκόσμια εξάπλωση διαφορετικών φυτικών ειδών, κυρίως στην Ευρώπη και την Ασία, στο βόρειο ημισφαίριο. Η οικογένεια περιλαμβάνει περισσότερα από εκατό διαφορετικά γένη και περισσότερα από 2000 αναγνωρισμένα φυτικά είδη, μεταξύ των οποίων τα γνωστά Myosotis, Lithospermum, Alkanna και Anchusa spp. Τα διαφορετικά αυτά είδη είναι καλά τεκμηριωμένα για τις θεραπευτικές τους ιδιότητες, οι οποίες αποδίδονται στο περιεχόμενο τους σε δευτερογενείς μεταβολίτες, όπως φλαβονοειδή, φαινυλοπροπανοειδή, σαπωνίνες και ναφθοκινόνες (π.χ. με καρδιοτονωτικές, αντιμικροβιακές, αντιπυρετικές και αντιασθματικές ιδιότητες). Μεταξύ των σημαντικότερων ενώσεων της οικογένειας συγκαταλέγονται τα λιπόφιλα παράγωγα ισοεξενυλοναφθαζαρίνης, αλκαννίνη και σικονίνη, γνωστά ως πηγές ερυθρών χρωστικών με πληθώρα βιολογικών ιδιοτήτων (π.χ. επούλωση τραυμάτων, αντιμικροβιακή και αντιφλεγμονώδη δράση). Στην παρούσα διατριβή, επικεντρώσαμε την έρευνά μας στην Alkanna tinctoria (L.) Tausch λόγω της ευρείας εξάπλωσής του φυτού στη λεκάνη της Μεσογείου, ιδιαίτερα στην Ελλάδα, καθώς και λόγω των ευεργετικών ιδιοτήτων που αποδίδονται στο συγκεκριμένο φυτικό είδος σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Για τον σκοπό αυτό, στα τρία πρώτα κεφάλαια της παρούσας μελέτης διερευνήσαμε αναδυόμενες μεθόδους εκχύλισης, όπως οι φυσικοί βαθιοί ευτηκτικοί διαλύτες (Natural Deep Eutectic Solvents, NaDES), με στόχο τη βελτίωση της απόδοσης και τη μείωση της εξάρτησης από οργανικούς διαλύτες. Στο Κεφάλαιο Ι πραγματοποιήθηκε εκτεταμένος έλεγχος φυσικών βαθιών ευτηκτικών διαλυτών (NaDESs) για την εκλεκτική εκχύλιση εναντιομερών υδροξυναφθοκινονών (HNQs) από τις ρίζες της Alkanna tinctoria (L.) Tausch, ενός μεσογειακού είδους γνωστού για τις φαρμακευτικές και καλλυντικές του εφαρμογές του. Αξιολογήθηκαν περισσότεροι από εξήντα εξατομικευμένοι NaDESs, με έμφαση στην επίδραση των εγγενών φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους στην αποδοτικότητα εκχύλισης και στην εναντιομερική εκλεκτικότητα. Η πολυπαραγοντική ανάλυση και η βελτιστοποίηση ενός παράγοντα κάθε φορά οδήγησαν στην αναγνώριση ενός ευτηκτικού μείγματος αποτελούμενου από λεβουλινικό οξύ και γλυκόζη (LeG) σε μοριακή αναλογία 5:1 με 20% νερό (w/w) ως τον αποτελεσματικότερο διαλύτη για την εκχύλιση HNQs. Περαιτέρω βελτιστοποίηση της διαδικασίας μέσω μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισης (RSM) αποκάλυψε ότι θερμοκρασία 45 °C, λόγος στερεού προς υγρό 30 mg/mL και χρόνος εκχύλισης 50 λεπτών μεγιστοποιούν την απόδοση HNQs στα 41,72 ± 1,04 mg/g που είναι συγκρίσιμη με αυτή συμβατικών οργανικών διαλυτών. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ανέδειξαν τους NaDESs ως μια ευέλικτη και φιλική προς το περιβάλλον εναλλακτική λύση για την αποδοτική και βιώσιμη εκχύλιση HNQs. Στο Κεφάλαιο ΙΙ προχωρήσαμε περαιτέρω προτείνοντας μεθόδους ανάκτησης HNQs από εκχυλίσματα ριζών της Alkanna tinctoria (L.) Tausch που παρασκευάστηκαν με NaDES τύπου LeG, συμπεριλαμβανομένης της εκχύλισης στερεάς φάσης, της χρήσης μακροπορώδους ρητίνης και του νερού ως αντιδιαλύτη. Πραγματοποιήθηκαν συγκριτικές αναλύσεις για την αντιμετώπιση του βασικού περιορισμού των NaDES, δηλαδή της μη πτητικής φύσης τους. Μεταξύ των μεθόδων που δοκιμάστηκαν, η εκχύλιση στερεάς φάσης σε φυσίγγιο αντίστροφης φάσης C8 πέτυχε την υψηλότερη περιεκτικότητα υδροξυναφθοκινονών (TNC) με τιμή 46,79 ± 0,95 mg/g ξηρού βάρους. Η μακροπορώδης ρητίνη Amberlite XAD 4 παρουσίασε επίσης υψηλή δυναμική ανάκτησης, με TNC 37,21 ± 1,79 mg/g ξηρού βάρους, ενώ η καταβύθιση με χρήση νερού ως αντιδιαλύτη απέδωσε TNC 28,68 ± 0,02 mg/g ξηρού βάρους. Επιπλέον, η διαδικασία κλιμάκωσης με χρήση Amberlite XAD 4 παρουσίασε υψηλή αποδοτικότητα ανάκτησης (34,13 ± 1,09 mg/g ξηρού βάρους, RSD < 15%) και επέτρεψε την ανακύκλωση του LeG_5_20 με ανάκτηση άνω του 50%. Η μελέτη αυτή αναδεικνύει την Amberlite XAD 4 ως υποσχόμενη λύση για εφαρμογές πιλοτικής κλίμακας και το σύστημα εκχύλισης βασισμένο σε NaDES ως εξαιρετική οικολογική εναλλακτική για την ανάκτηση HNQs. Στο Κεφάλαιο ΙΙΙ κρίθηκε εξαιρετικά σημαντικό να διερευνηθούν οι περιβαλλοντικές και υγειονομικές επιπτώσεις της εκχυλιστικής διαδικασίας που αναπτύχθηκε με χρήση NaDES, ώστε να απαντηθεί το εξής ερώτημα: αρκεί η χρήση του LeG_5_20 NaDES για να καταστήσει «πράσινη» τη διαδικασία εκχύλισης HNQs από ρίζες του Alkanna tinctoria (L.) Tausch; Για τον λόγο αυτό αναπτύχθηκε ένα νέο και ολοκληρωμένο εργαλείο, ο Δείκτης Πράσινης Εκχυλιστικής Διαδικασίας (Green Extraction Process Index, GEPI), για την αξιολόγηση της «πρασινότητας» μιας ολόκληρης εκχυλιστικής διαδικασίας. Εμπνευσμένο από τα εργαλεία Analytical Eco-Scale και Green Analytical Procedure Index (GAPI), το GEPI χρησιμοποιεί εικονογράμματα με χρωματική κλίμακα (πράσινο, κίτρινο, κόκκινο) για την ταξινόμηση των περιβαλλοντικών και επιπτώσεων στην ανθρώπινη υγεία σε κάθε στάδιο, από την προμήθεια πρώτων υλών έως τη διαχείριση αποβλήτων. Στη μελέτη αυτή, το GEPI εφαρμόστηκε για τη σύγκριση της συμβατικής πετρελαϊκής εκχύλισης εναντιομερών υδροξυναφθοκινονών (HNQs) από ρίζες της Alkanna tinctoria (L.) Tausch με μια νέα «πράσινη» εναλλακτική που χρησιμοποιεί NaDES. Η ανάλυση επιβεβαίωσε ότι οι NaDES, και ειδικότερα ο LeG_5_20, βελτίωσαν σημαντικά την περιβαλλοντική βιωσιμότητα της εκχυλιστικής διαδικασίας, προσφέροντας αδιαμφισβήτητα πλεονεκτήματα ως προς την απόδοση και την αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, το GEPI ανέδειξε επίσης τη σημασία της αξιολόγησης ολόκληρης της διαδικασίας εκχύλισης, επισημαίνοντας ζητήματα που σχετίζονται με την προέλευση των πρώτων υλών, την προεπεξεργασία και τη μετα-εκχυλιστική επεξεργασία, παρέχοντας έτσι μια ολιστική αξιολόγηση του «πράσινου» χαρακτήρα των μεθόδων εκχύλισης. Επιπρόσθετα της ανάπτυξης μίας πράσινης μεθόδου εκχύλισης και ανάκτησης των HNQs από τις ρίζες του φυτού Alkanna tinctoria (L.) Tausch, η διερεύνηση σύγχρονων τεχνολογιών με την χρήση υδροπονικών και βιοτεχνολογικών καλλιεργειών μπορεί να ενισχύσει τη βιωσιμότητα και την αποδοτικότητα, μεγιστοποιώντας την αξιοποίηση των πολύτιμων βιοδραστικών ενώσεων του φυτού, αποφεύγοντας παράλληλα τη μαζική εκμετάλλευση φυσικών πληθυσμών που συχνά οδηγεί στην εξάντληση των αυτοφυών φυτών. Στο πλαίσιο αυτό, στο Κεφάλαιο IV προωθήσαμε περαιτέρω τις ερευνητικές μας προσπάθειες και παρουσιάσαμε μία νέα προσέγγιση για τη βιώσιμη καλλιέργεια και εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από τις ρίζες της Alkanna tinctoria (L.) Tausch, εστιάζοντας στα εναντιομερή των υδροξυναφθοκινόνων (HNQs), τα οποία είναι γνωστά για τις φαρμακευτικές και κοσμητολογικές τους εφαρμογές. Χρησιμοποιώντας ένα υδροπονικό σύστημα τύπου nutrient film technique (NFT), η έρευνα κατάφερε να εγκαθιδρύσει ένα ex situ σύστημα καλλιέργειας που παρουσίασε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως προς την προσαρμογή των φυτών, την ανάπτυξη και την παραγωγή ριζικής βιομάζας. Παράλληλα, η μελέτη αξιολόγησε έναν φυσικό βαθύ ευτηκτικό διαλύτη (NaDES), και συγκεκριμένα ένα μίγμα λεβουλινικού οξέος–γλυκόζης (LeG_5_20), ως μία πράσινη εναλλακτική μέθοδο εκχύλισης. Οι προκαταρκτικές αξιολογήσεις τοξικότητας έδειξαν ότι η βραχυχρόνια έκθεση των φυτών στους NaDES προκάλεσε ελάχιστο στρες, ενώ η παρατεταμένη έκθεση εμφάνισε σημαντικές επιδράσεις. Η ενσωμάτωση υδροπονικών συστημάτων με εκχύλιση μέσω NaDES προσφέρει μία βιώσιμη και μη καταστροφική μέθοδο ανάκτησης βιοδραστικών ενώσεων, ανοίγοντας τον δρόμο για φιλικές προς το περιβάλλον λύσεις στην εκχύλιση φυσικών προϊόντων και στις προσπάθειες διατήρησης φυτικών πόρων. Πέρα από την ανάπτυξη ενός υδροπονικού συστήματος καλλιέργειας τύπου nutrient film, κρίθηκε απαραίτητη και η διερεύνηση καλλιεργειών κυττάρων in vitro της Alkanna tinctoria (L.) Tausch, καθώς και η διέγερσή τους μέσω ενδοφυτικών βακτηρίων που είχαν προηγουμένως απομονωθεί από φυτά της oικογένειας Boraginaceae. Για τον λόγο αυτό, στο Κεφάλαιο V εφαρμόστηκε μία μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση με χρήση Υπερυψηλής Απόδοσης Υγρής Χρωματογραφίας συζευγμένη με Φασματομετρία Μάζας (UHPLC-MS) σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή ανάλυση δεδομένων, προκειμένου να διερευνηθεί σε συγκαλλιέργειες η αλληλεπίδραση μεταξύ καλλιεργειών κυτταρικού εναιωρήματος της Alkanna tinctoria (L.) Tausch και οκτώ ενδοφυτικών βακτηρίων. Η επίδραση των ενδοφυτικών βακτηρίων στην παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών (SMs) αξιολογήθηκε μέσω ανάλυσης κύριων συνιστωσών (PCA) και ιεραρχικής ομαδοποίησης, αποκαλύπτοντας σημαντικές τροποποιήσεις στο μεταβολικό προφίλ. Συνολικά, αρκετές διμερείς και τετραμερείς ενώσεις (όπως οι 8’-αποκαρβοξυ-ροσμαρινικό οξύ, το 8’’’-αποκαρβοξυ-σαλβανoλικό Β και το 8’’-8’’’-δι-αποκαρβοξυ-σαλβιανολικό οξύ Β), καθώς και η 3’-υδροξυ-14-υδροξυ-σικονοφουρανη Η, ταυτοποιήθηκαν κατά προσέγγιση για πρώτη φορά στην Alkanna tinctoria (L.) Tausch. Τα ευρήματά μας κατέδειξαν ότι συγκεκριμένα βιοσυνθετικά μονοπάτια παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών επηρεάζονται από την αλληλεπίδραση με ενδοφυτικούς μικροοργανισμών, υπό ελεγχόμενα συστήματα καλλιέργειας in vitro. Η μελέτη παρέχει νέα δεδομένα σχετικά με τη δυνητική εφαρμογή της συγκαλλείεργειας κυττάρων με ενδοφυτικούς μιρκοοργανισμούς για την ενίσχυση της παραγωγής βιοδραστικών μεταβολιτών υψηλής αξίας στα φυτά. Συμπερασματικά, οι προσπάθειές μας επικεντρώθηκαν κυρίως στην ανάπτυξη μεθόδου εκχύλισης με την χρήση των NADES για την ανάκτηση των HNQs, από το φαρμακευτικό φυτό Alkanna tinctoria (L.) Tausch ex situ ή και in situ. Επιπλέον, εστιάσαμε στην ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου μεταβολομικού πρωτοκόλλου, σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή ανάλυση δεδομένων, το οποίο μπορεί να εφαρμοστεί αποτελεσματικά για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ κυττάρων in vitro της Alkanna tinctoria (L.) Tausch και ενδοφυτικών βακτηρίων σε συστήματα συγκαλλιέργειας, με στόχο την ενίσχυση της παραγωγής των HNQs