Γονιδιακό /πρωτεϊνικό προφίλ και υποκείμενοι μηχανισμοί της αυτοφαγίας στις αιματολογικές κακοήθειες

Abstract

Myelodysplastic neoplasms (MDS) are a heterogeneous group of clonal hematopoietic stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis, dysplasia of one or more hematopoietic lineages, peripheral blood cytopenias, and an increased risk of progression to acute myeloid leukemia. The most widely used prognostic classification system is the Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R), according to which patients are classified into five risk categories: very low, low, intermediate, high, and very high risk. The pathogenesis of MDS is multifactorial and involves genetic, epigenetic, and microenvironmental abnormalities affecting key pathways involved in cellular homeostasis. Despite significant advances in understanding the biology of MDS, the precise molecular mechanisms contributing to disease initiation, progression, and response to therapy remain largely unknown. Autophagy and apoptosis are two fundamental cellular processes that play crucial roles in regulating cell survival, the removal of damaged organelles and proteins, and programmed cell death. Autophagy functions as a recycling mechanism for cellular components and as an adaptive response to cellular stress, whereas apoptosis represents the primary mechanism for eliminating abnormal or dysfunctional cells. Dysregulation of the balance between these two processes has been associated with the development and progression of several neoplastic diseases, including MDS. However, their exact role in the pathophysiology of MDS, particularly in distinguishing low-risk from high-risk disease, has not yet been fully elucidated. This dissertation aimed to investigate the molecular mechanisms of autophagy and apoptosis in MDS at both the gene and protein expression levels, as well as to evaluate the effects of azacitidine, a hypomethylating agent widely used in the treatment of MDS, on these mechanisms. To achieve this objective, a combined experimental approach was employed, including the analysis of samples from patients with different prognostic categories of MDS, as well as an in vitro study using the MDS cell line (MDS-L).The study population consisted of 34 patients, including 13 low-risk and 21 high-risk MDS patients, as well as 23 healthy donors. None of the patients had received prior treatment. Patients were classified according to the Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R) into two major categories: low-risk (LR) and high-risk (HR). The LR group included patients with very low, low, and intermediate risk (IPSS-R ≤ 4.5), whereas the HR group included patients with high and very high risk (IPSS-R > 4.5). Bone marrow samples were collected from all patients, while peripheral blood samples were obtained from healthy donors. Leukocytes, RNA, DNA, and proteins were isolated from all samples. In the first stage, expression patterns of autophagy-related genes were investigated using RT² Profiler PCR Array technology. A total of 84 genes involved in different stages of the autophagic process were analyzed, including genes associated with autophagy initiation, autophagosome formation, cargo transport, and lysosomal fusion. The analysis demonstrated that 39 out of the 84 genes exhibited significantly reduced expression in MDS patients compared with healthy donors. These included key autophagy-related genes such as UVRAG, AMBRA1, PI3KC3, ATG5, ATG12, ATG16L1, DRAM1, DRAM2, and MAP1LC3B. In contrast, TGM2 was the only gene found to be significantly overexpressed in MDS patients.12 Genes exhibiting significant expression differences were selected for further validation by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in a larger number of samples. The qRT-PCR results confirmed the significant downregulation of PI3KC3, UVRAG, ATG5, ATG16L1, DRAM1, and MAP1LC3B expression in MDS patients, whereas TGM2 expression was significantly increased. Although no statistically significant differences were observed between low-risk and high-risk patients, HR patients consistently exhibited lower expression levels of most autophagy-related genes, suggesting a possible association between autophagy dysregulation and disease progression. Protein expression analysis by Western blot further confirmed these findings at the protein level. Specifically, PI3K, AMBRA1, UVRAG, ATG5, ATG12, ATG16, LC3B, and DRAM1 proteins showed significantly reduced expression in MDS patients compared with healthy donors, whereas TGM2 protein expression was increased. Furthermore, HR patients exhibited lower expression levels of autophagy-related proteins compared with LR patients, supporting the hypothesis that progressive suppression of autophagic activity is associated with a more aggressive biological behavior of the disease. In the second part of the study, the MDS-L cell line was used as an in vitro MDS model to investigate the effects of azacitidine on autophagy and apoptosis mechanisms. Initially, cell viability was assessed using the trypan blue exclusion assay in order to determine the appropriate drug concentration. Based on the results, a concentration of 0.5 μM azacitidine for 48 hours was selected, as it induced limited cytotoxicity (IC10), allowing the investigation of molecular alterations without extensive cell death.Gene expression analysis following exposure of cells to azacitidine revealed significant upregulation of genes associated with autophagy and apoptosis. Specifically, increased expression of the BECN1, ATG5, DRAM1, and MAP1LC3B genes was observed, suggesting activation of autophagic flux. Simultaneously, a significant increase in the expression of the apoptotic genes CASP3, CASP7, and CASP8 was detected, whereas the anti-apoptotic gene BCL-2 showed significantly decreased expression. These findings indicate that azacitidine simultaneously activates both autophagic and apoptotic pathways in MDS cells. Investigation of signaling pathways through phosphorylation analysis of 21 proteins using multiplex ELISA demonstrated significant alterations in pathways associated with cell survival and proliferation. Specifically, azacitidine suppressed the AKT/mTOR, NF-κB, and STAT3 pathways, which are associated with cell survival, while simultaneously activating p53 and ERK1 proteins involved in apoptosis and the cellular stress response. These findings were further confirmed at the protein level by Western blot analysis, where increased expression of BECN1, ATG5, and LC3II proteins, along with reduced BCL-2 expression, was observed. Overall, the findings of the present dissertation demonstrate that autophagy and apoptosis pathways are significantly dysregulated in MDS and that this dysregulation may contribute to disease pathogenesis and progression. Furthermore, the study highlights that azacitidine significantly affects the molecular pathways regulating autophagy and apoptosis, partially restoring the balance between these processes. These findings contribute to a more comprehensive understanding of the molecular biology of MDS and identify potential biomarkers and therapeutic targets that may support the development of more personalized and effective therapeutic strategies.

Τα Μυελοδυσπλαστικά Νεοπλάσματα (ΜΔΣ) αποτελούν ετερογενή ομάδα κλωνικών διαταραχών των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών, οι οποίες χαρακτηρίζονται από αναποτελεσματική αιμοποίηση, δυσπλασία μίας ή περισσότερων αιμοποιητικών σειρών, περιφερικές κυτταροπενίες και αυξημένο κίνδυνο εξέλιξης σε οξεία μυελογενή λευχαιμία. Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη προγνωστική ταξινόμηση είναι το Revised International Prognostic Scoring System (IPSS-R), με βάση το οποίο οι ασθενείς με ΜΔΣ κατατάσσονται σε πέντε κατηγορίες κινδύνου: πολύ χαμηλού, χαμηλού, ενδιάμεσου, υψηλού και πολύ υψηλού κινδύνου. Η παθογένεια των ΜΔΣ είναι πολυπαραγοντική και περιλαμβάνει γενετικές, επιγενετικές και μικροπεριβαλλοντικές διαταραχές που επηρεάζουν κρίσιμους μηχανισμούς κυτταρικής ομοιόστασης. Παρά τη σημαντική πρόοδο στην κατανόηση της βιολογίας των ΜΔΣ, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που συμβάλλουν στην έναρξη, εξέλιξη και ανταπόκριση στη θεραπεία της νόσου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Η αυτοφαγία και η απόπτωση αποτελούν δύο θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες, οι οποίες διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής επιβίωσης, της απομάκρυνσης κατεστραμμένων οργανιδίων και πρωτεϊνών, καθώς και του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Η αυτοφαγία λειτουργεί ως μηχανισμός ανακύκλωσης κυτταρικών συστατικών και προσαρμογής σε συνθήκες κυτταρικού στρες, ενώ η απόπτωση αποτελεί τον κύριο μηχανισμό απομάκρυνσης παθολογικών ή δυσλειτουργικών κυττάρων. Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των δύο αυτών μηχανισμών έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη και εξέλιξη πολλών νεοπλασματικών νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένων των ΜΔΣ. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος τους στην παθοφυσιολογία των ΜΔΣ και ιδιαίτερα στη διαφοροποίηση μεταξύ χαμηλού και υψηλού κινδύνου νόσου, δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της αυτοφαγίας και της απόπτωσης στα ΜΔΣ, τόσο σε επίπεδο γονιδιακής όσο και πρωτεϊνικής έκφρασης, καθώς και η αξιολόγηση της επίδρασης της αζακυτιδίνης, ενός υπομεθυλιωτικού παράγοντα που χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία των ΜΔΣ, στους μηχανισμούς αυτούς. Για την επίτευξη του σκοπού εφαρμόστηκε συνδυαστική πειραματική προσέγγιση, η οποία περιλάμβανε ανάλυση δειγμάτων ασθενών με ΜΔΣ διαφορετικής προγνωστικής κατηγορίας, καθώς και in vitro μελέτη στην κυτταρική σειρά ΜΔΣ (MDS-L). Η ομάδα μελέτης αποτελούνταν από 34 ασθενείς,13 χαμηλού και 21 υψηλού κινδύνου με ΜΔΣ και 23 υγιείς δότες. Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε λάβει προηγούμενη θεραπεία. Η ταξινόμηση των ασθενών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το Αναθεωρημένο Διεθνές Σύστημα Προγνωστικής Βαθμολογίας (IPSS-R) σε δύο κύριες κατηγορίες: ασθενείς χαμηλού κινδύνου (ΧΚ) και ασθενείς υψηλού κινδύνου (ΥΚ). Στην κατηγορία ΧΚ εντάχθηκαν οι ασθενείς με πολύ χαμηλό, χαμηλό και ενδιάμεσο κίνδυνο (IPSS-R ≤ 4.5), ενώ στην κατηγορία ΥΚ οι ασθενείς με υψηλό και πολύ υψηλό κίνδυνο (IPSS-R > 4.5). Από όλους τους ασθενείς συλλέχθηκαν δείγματα μυελού των οστών, ενώ από τους υγιείς δότες δείγματα περιφερικού αίματος. Σε όλα τα δείγματα πραγματοποιήθηκε απομόνωση λευκοκυττάρων, RNA, DNA και πρωτεϊνών. Σε πρώτο στάδιο, διερευνήθηκαν τα πρότυπα έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την αυτοφαγία μέσω της τεχνολογίας RT² Profiler PCR Array. Συνολικά αναλύθηκαν 84 γονίδια που συμμετέχουν σε διαφορετικά στάδια της αυτοφαγικής διαδικασίας, συμπεριλαμβανομένων της έναρξης της αυτοφαγίας, του σχηματισμού του αυτοφαγοσώματος, της μεταφοράς φορτίου και της σύντηξης με το λυσόσωμα. Η ανάλυση έδειξε ότι 39 από τα 84 γονίδια παρουσίαζαν σημαντικά μειωμένη έκφραση στους ασθενείς με ΜΔΣ σε σύγκριση με τους υγιείς δότες. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονταν βασικά γονίδια του μηχανισμού αυτοφαγίας, όπως τα UVRAG, AMBRA1, PI3KC3, ATG5, ATG12, ATG16L1, DRAM1, DRAM2 και MAP1LC3B. Αντίθετα, το γονίδιο TGM2 ήταν το μοναδικό γονίδιο που εμφάνισε σημαντική υπερέκφραση στους ασθενείς με ΜΔΣ. Τα γονίδια που παρουσίασαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην έκφρασή τους επιλέχθηκαν για περαιτέρω επιβεβαίωση με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR επιβεβαίωσαν τη σημαντική μείωση της έκφρασης των PI3KC3, UVRAG, ATG5, ATG16L1, DRAM1 και MAP1LC3B στους ασθενείς με ΜΔΣ, ενώ η έκφραση του TGM2 ήταν σημαντικά αυξημένη. Παρότι δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ ασθενών χαμηλού (ΧΚ) και υψηλού κινδύνου (ΥΚ), οι ασθενείς ΥΚ εμφάνιζαν σταθερά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των περισσότερων γονιδίων της αυτοφαγίας, εύρημα που υποδηλώνει πιθανή συσχέτιση της απορρύθμισης της αυτοφαγίας με την εξέλιξη της νόσου. Η ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης μέσω Western blot επιβεβαίωσε τα παραπάνω ευρήματα σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες PI3K, AMBRA1, UVRAG, ATG5, ATG12, ATG16, LC3B και DRAM1 παρουσίαζαν σημαντικά μειωμένη έκφραση στους ασθενείς με ΜΔΣ συγκριτικά με τους υγιείς δότες, ενώ η πρωτεΐνη TGM2 εμφάνιζε αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον, οι ασθενείς ΥΚ παρουσίαζαν χαμηλότερη έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αυτοφαγία συγκριτικά με τους ασθενείς ΧΚ, ενισχύοντας την υπόθεση ότι η προοδευτική καταστολή της αυτοφαγικής δραστηριότητας συνδέεται με επιθετικότερη βιολογική συμπεριφορά της νόσου. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, η κυτταρική σειρά MDS-L χρησιμοποιήθηκε ως in vitro μοντέλο ΜΔΣ για τη διερεύνηση της επίδρασης της αζακυτιδίνης στους μηχανισμούς της αυτοφαγίας και της απόπτωσης. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της κυτταρικής βιωσιμότητας με τη μέθοδο trypan blue, προκειμένου να προσδιοριστεί η κατάλληλη συγκέντρωση του φαρμάκου. Με βάση τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε συγκέντρωση 0,5 μΜ αζακυτιδίνης για χρονικό διάστημα 48 ωρών, καθώς προκαλούσε περιορισμένη κυτταροτοξικότητα (IC10), επιτρέποντας τη μελέτη των μοριακών μεταβολών χωρίς εκτεταμένο κυτταρικό θάνατο. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης μετά από έκθεση των κυττάρων στην αζακυτιδίνη ανέδειξε σημαντική ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την αυτοφαγία και την απόπτωση. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των BECN1, ATG5, DRAM1 και MAP1LC3B γονιδίων, εύρημα που υποδηλώνει ενεργοποίηση της αυτοφαγικής ροής. Παράλληλα, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της έκφρασης των αποπτωτικών γονιδίων CASP3, CASP7 και CASP8, ενώ το αντι-αποπτωτικό γονίδιο BCL-2 παρουσίασε σημαντική μείωση της έκφρασής του. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η αζακυτιδίνη ενεργοποιεί ταυτόχρονα τόσο τους μηχανισμούς της αυτοφαγίας όσο και της απόπτωσης στα κύτταρα ΜΔΣ. Η διερεύνηση των σηματοδοτικών μονοπατιών μέσω ανάλυσης φωσφορυλίωσης 21 πρωτεϊνών με τη μέθοδο multiplex ELISA ανέδειξε σημαντικές μεταβολές σε μονοπάτια που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Συγκεκριμένα, η αζακυτιδίνη προκάλεσε καταστολή των μονοπατιών AKT/mTOR, NF-κB και STAT3, τα οποία σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση, ενώ παράλληλα ενεργοποίησε τις πρωτεΐνες p53 και ERK1, που σχετίζονται με την απόπτωση και την κυτταρική απάντηση στο στρες. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και σε πρωτεϊνικό επίπεδο μέσω Western blot, όπου παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών BECN1, ATG5 και LC3II, καθώς και μείωση της BCL-2. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν ότι οι μηχανισμοί της αυτοφαγίας και της απόπτωσης είναι σημαντικά απορρυθμισμένοι στα ΜΔΣ και ότι η διαταραχή αυτή ενδέχεται να συμβάλλει στην παθογένεια και εξέλιξη της νόσου. Επιπλέον, η μελέτη αναδεικνύει ότι η αζακυτιδίνη επηρεάζει σημαντικά τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν την αυτοφαγία και την απόπτωση, αποκαθιστώντας εν μέρει τη λειτουργική ισορροπία των μηχανισμών αυτών. Τα ευρήματα της διατριβής συμβάλλουν στην πληρέστερη κατανόηση της μοριακής βιολογίας των ΜΔΣ και αναδεικνύουν πιθανούς βιοδείκτες και θεραπευτικούς στόχους, οι οποίοι θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την ανάπτυξη περισσότερο εξατομικευμένων και αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων.