Integrated approach for hydrocarbon degradation in deep sea environments using different bioremediation agents

Abstract

Petroleum hydrocarbons enter the marine environment through natural processes and anthropogenic activities. Although chronic and diffuse inputs account for a large part of total hydrocarbon loading, accidental offshore spills can produce severe environmental consequences. Deep-sea spills are especially challenging because released hydrocarbons may be distributed across different parts of the marine environment, reaching the sea surface, remaining in the water column as hydrocarbon plumes, being transported toward shorelines, or being deposited in sediments. The 2010 Deepwater Horizon (DWH) blowout highlighted this complexity by showing how difficult it is to predict the behavior of a deep-sea spill. During the DWH incident, more than 7 million liters of dispersants were applied both at the sea surface and through subsea injection, aiming to reduce the amount of oil reaching the surface and promote the formation of smaller droplets. The same incident also highlighted biodegradation as a key natural mechanism of hydrocarbon removal in the deep marine environment, as indigenous microbial communities contributed substantially to hydrocarbon removal within deep plumes. However, deep-sea biodegradation remains difficult to assess experimentally, because most studies have been conducted under atmospheric pressure or with samples recompressed in the laboratory, which may not fully reflect in situ conditions. This need is particularly relevant for the Eastern Mediterranean Sea, where offshore hydrocarbon exploration is expanding into deep and ultradeep marine environments, while relevant experimental studies and simulations for the region remain limited. The semi-enclosed character of the Eastern Mediterranean Sea, its complex circulation, and the proximity of potential exploration areas to sensitive coastal zones make spill preparedness especially important. This PhD thesis investigates whether indigenous deep-sea microbial populations from the Eastern Mediterranean Sea can degrade crude oil under high-pressure (HP) conditions, and how different bioremediation strategies affect degradation efficiency. In parallel, it examines the biotechnological potential of these microorganisms under high pressure and uses the OSCAR model to estimate hydrocarbon fate and potential environmental exposure following hypothetical ultradeep subsea spills southwest of Crete. Deep-sea seawater samples from 600–1,000 m depth were collected southwest of Crete using a custom-built HP sampling system capable of preserving hydrostatic pressure during retrieval. The samples were transferred without depressurization into an HP-Reactor using an HP piston pump. Biodegradation experiments were conducted under simulated deep-sea conditions (10 MPa, 14 oC) using crude oil at plume-relevant concentrations, with and without COREXIT™ EC9500A dispersant. The microbial community responded rapidly to hydrocarbon exposure under pressure, with no evident lag phase, and showed substantial apparent removal of both aliphatic and aromatic hydrocarbons (>70%) under HP conditions. Dispersant addition did not appear to further enhance biodegradation; however, hydrocarbon removal remained high in the presence of dispersant, indicating that COREXIT™ EC9500A did not suppress the biodegradation capacity of the community under the tested conditions. The enriched microbial community obtained from these initial experiments was subsequently used in 56-day HP bioremediation experiments under higher crude-oil loading (0.5% v/v). Four treatments were compared: control, dispersant addition, nutrient addition, and combined nutrient–dispersant amendment. Nutrient addition was supplied at a C:N:P ratio of 100:10:1 w/w/w, while dispersant was applied at a 1:25 v/v dispersant-to-oil ratio. Hydrocarbon removal occurred in all treatments, confirming that the community retained its biodegradation capacity under HP conditions and increased oil loading. Nutrient addition supported stronger microbial growth and biodegradation, while the combined nutrient–dispersant approach produced the strongest overall response. Biodegradation appeared to depend primarily on nutrient availability, whereas the effect of dispersant was smaller and varied among the different phases of the experiment.Building on the demonstrated biodegradation capacity of the community, its biosurfactant-producing potential was further examined under HP conditions. The community was incubated at 10 MPa and 14 oC with crude oil (0.5% v/v) and nutrients. Biosurfactant activity was detected after 9 days using qualitative screening assays. Glycolipid-type biosurfactants were isolated, fractionated, and characterized, yielding 41.3 mg L⁻¹ of rhamnolipids, equivalent to 10 mg g⁻¹ of added oil or approximately 1% w/w relative to the initial crude-oil amount. TLC analysis indicated the presence of mono- and di-rhamnolipid fractions, FTIR supported the glycolipid nature of the isolated fractions, and GC–MS identified β-hydroxy fatty acid profiles, including saturated chain lengths from C6:0 to C18:0. The amount of rhamnolipids produced was theoretically sufficient to cover oil droplets with diameters of approximately 1–2 μm, suggesting substantial surface-active potential under deep-sea conditions. The modelling component assessed hypothetical ultradeep subsea hydrocarbon releases southwest of Crete using the OSCAR oil-spill modelling framework. Sixty-four scenarios were simulated for four release types: light crude oil (LC), light crude oil with associated gas release (LC-G), gas condensate (GC), and gas condensate with associated gas release (GC-G). Hydrocarbon composition exerted the strongest control on simulated oil fate, outweighing the effects of season, release rate, and subsea dispersant injection (SSDI). In LC and LC-G scenarios, a larger fraction of the oil remained at the surface and was associated with greater shoreline exposure, whereas GC and GC-G scenarios led to greater hydrocarbon retention in the water column and showed no shoreline deposition in the simulations. Modelled primary biodegradation represented the largest mass-balance component and varied strongly with hydrocarbon composition, increasing from 22.2% for LC to 43.0% for LC-G, 60.5% for GC, and >80% for GC-G. SSDI had a secondary and hydrocarbon-dependent effect, reducing the presence of oil at the surface and increasing hydrocarbon retention in the water column. Seasonal conditions mainly affected transport pathways and shoreline exposure, with summer conditions favoring greater coastal deposition and winter conditions producing broader offshore dispersion. This thesis demonstrates the value of maintaining hydrostatic pressure for studying deep-sea hydrocarbon biodegradation under conditions that more closely represent the natural deep-sea environment. Indigenous deep-sea microbial communities from the Eastern Mediterranean Sea showed strong capacity to remove hydrocarbons under pressure, responded primarily to nutrient availability during oil-rich bioremediation experiments, and produced structurally diverse rhamnolipids with potential biotechnological relevance. The modelling component further showed that the consequences of an ultradeep subsea blowout in the Eastern Mediterranean Sea depend strongly on hydrocarbon composition, with crude oil scenarios leading mainly to surface and shoreline exposure and condensate/gas-rich scenarios leading mainly to water-column retention and subsurface exposure. Together, the experimental and modelling results provide an evidence-based, pressure-relevant, and region-specific basis for improving deep-sea oil-spill assessment, biodegradation parameterization, and preparedness planning in the Eastern Mediterranean Sea.

Οι πετρελαϊκοί υδρογονάνθρακες εισέρχονται στο θαλάσσιο περιβάλλον μέσω φυσικών διεργασιών και ανθρωπογενών δραστηριοτήτων. Παρότι μεγάλο μέρος της συνολικής επιβάρυνσης προέρχεται από χρόνιες και διάχυτες πηγές, οι ατυχηματικές υπεράκτιες διαρροές μπορούν να προκαλέσουν σοβαρές περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Οι διαρροές σε μεγάλα βάθη είναι ιδιαίτερα σύνθετες, καθώς οι υδρογονάνθρακες μπορούν να κατανεμηθούν διαφορετικά στο θαλάσσιο περιβάλλον, να φτάσουν στην επιφάνεια, να παραμείνουν στη στήλη του νερού ως νέφη υδρογονανθράκων (πλούμια), να μεταφερθούν προς την ακτογραμμή ή να καταλήξουν στα ιζήματα. Το ατύχημα του Deepwater Horizon (DWH) το 2010 έδειξε πόσο δύσκολο είναι να προβλεφθεί η συμπεριφορά μιας διαρροής σε μεγάλο βάθος. Κατά τη διάρκειά του εφαρμόστηκαν περισσότερα από 7 εκατομμύρια λίτρα διασκορπιστικών ουσιών τόσο στην επιφάνεια όσο και μέσω υποθαλάσσιας έγχυσης, με στόχο τη μείωση του πετρελαίου που θα έφτανε στην επιφάνεια και τη δημιουργία μικρότερων σταγονιδίων. Το ίδιο περιστατικό ανέδειξε επίσης τη βιοαποδόμηση ως βασικό μηχανισμό φυσικής απομάκρυνσης υδρογονανθράκων στο βαθύ θαλάσσιο περιβάλλον, καθώς οι αυτόχθονες μικροβιακές κοινότητες συνέβαλαν σημαντικά στην απομάκρυνση των υδρογονανθράκων μέσα στα βαθιά πλούμια. Ωστόσο, η βιοαποδόμηση στη βαθιά θάλασσα παραμένει δύσκολο να εκτιμηθεί πειραματικά, επειδή οι περισσότερες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε ατμοσφαιρική πίεση ή με δείγματα που επανασυμπιέστηκαν στο εργαστήριο και ενδέχεται να μην αποτυπώνουν πλήρως τις in situ συνθήκες. Η ανάγκη αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική για την Ανατολική Μεσόγειο, όπου η υπεράκτια έρευνα υδρογονανθράκων επεκτείνεται σε βαθιά και υπερβαθέα θαλάσσια περιβάλλοντα, ενώ οι σχετικές πειραματικές μελέτες και προσομοιώσεις για την περιοχή είναι ακόμη περιορισμένες. Ο ημίκλειστος χαρακτήρας της περιοχής, η σύνθετη κυκλοφορία των υδάτων και η εγγύτητα περιοχών έρευνας σε ευαίσθητες παράκτιες ζώνες καθιστούν την ετοιμότητα για περιστατικά ρύπανσης ιδιαίτερα σημαντική. Η παρούσα διατριβή εξετάζει εάν οι αυτόχθονες μικροβιακοί πληθυσμοί της Ανατολικής Μεσογείου μπορούν να αποδομήσουν αργό πετρέλαιο υπό συνθήκες υψηλής πίεσης (ΥΠ), και πώς διαφορετικές στρατηγικές βιοεξυγίανσης επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της διεργασίας. Παράλληλα, εξετάζει το βιοτεχνολογικό δυναμικό των μικροοργανισμών υπό υψηλή πίεση και χρησιμοποιεί το μοντέλο OSCAR για να εκτιμήσει την πορεία των υδρογονανθράκων και την πιθανή περιβαλλοντική έκθεση μετά από υποθετικές υποθαλάσσιες διαρροές σε πολύ μεγάλα βάθη νοτιοδυτικά της Κρήτης. Δείγματα θαλασσινού νερού από 600–1,000 m βάθους συλλέχθηκαν νοτιοδυτικά της Κρήτης με ειδικά σχεδιασμένο δειγματολήπτη ΥΠ, ικανό να διατηρεί την υδροστατική πίεση κατά την ανάκτηση. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν χωρίς αποσυμπίεση σε αντιδραστήρα ΥΠ μέσω εμβολοφόρου αντλίας ΥΠ. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα βιοαποδόμησης υπό προσομοιωμένες συνθήκες βαθιάς θάλασσας (10 MPa, 14 oC), με αργό πετρέλαιο σε συγκεντρώσεις σχετικές με πλούμια υδρογονανθράκων. Τα πειράματα αξιολόγησαν επίσης την επίδραση του διασκορπιστικού COREXIT™ EC9500A. Η μικροβιακή κοινότητα αποκρίθηκε γρήγορα στην έκθεση σε υδρογονάνθρακες υπό πίεση, χωρίς εμφανή φάση υστέρησης, και παρουσίασε σημαντική φαινομενική απομάκρυνση τόσο αλειφατικών όσο και αρωματικών υδρογονανθράκων, με ποσοστά >70% υπό συνθήκες ΥΠ. Η προσθήκη διασκορπιστικού δεν φάνηκε να ενισχύει περαιτέρω τη βιοαποδόμηση. Παρόλα αυτά, η απομάκρυνση υδρογονανθράκων παρέμεινε υψηλή και παρουσία διασκορπιστικού, δείχνοντας ότι το COREXIT™ EC9500A δεν κατέστειλε την ικανότητα βιοαποδόμησης της κοινότητας υπό τις εξεταζόμενες συνθήκες. Η εμπλουτισμένη μικροβιακή κοινότητα που προέκυψε από τα αρχικά πειράματα χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε πειράματα βιοεξυγίανσης διάρκειας 56 ημερών, υπό συνθήκες ΥΠ και αυξημένη συγκέντρωση αργού πετρελαίου (0,5% v/v). Συγκρίθηκαν τέσσερις συνθήκες: Πείραμα ελέγχου, Προσθήκη διασκορπιστικού, Προσθήκη θρεπτικών και Συνδυασμένη προσέγγιση. Η προσθήκη θρεπτικών έγινε με αναλογία C:N:P 100:10:1 w/w/w, ενώ το διασκορπιστικό εφαρμόστηκε σε αναλογία 1:25 v/v ως προς το πετρέλαιο. Απομάκρυνση υδρογονανθράκων παρατηρήθηκε σε όλα τα πειράματα, επιβεβαιώνοντας ότι η κοινότητα διατήρησε την ικανότητα αποδόμησης πετρελαίου υπό συνθήκες ΥΠ και αυξημένου πετρελαϊκού φορτίου. Η προσθήκη θρεπτικών ουσιών υποστήριξε ισχυρότερη μικροβιακή αύξηση και βιοαποδόμηση, ενώ η συνδυασμένη προσέγγιση θρεπτικών–διασκορπιστικού οδήγησε στη μεγαλύτερη συνολική απόκριση. Η βιοαποδόμηση φάνηκε να εξαρτάται κυρίως από τη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών, ενώ η επίδραση του διασκορπιστικού ήταν μικρότερη και διαφοροποιήθηκε μεταξύ των φάσεων του πειράματος.Με βάση την αποδεδειγμένη ικανότητα βιοαποδόμησης της κοινότητας, εξετάστηκε στη συνέχεια το δυναμικό της για παραγωγή βιοεπιφανειοδραστικών ενώσεων υπό συνθήκες ΥΠ. Η κοινότητα επωάστηκε στους 10 MPa και στους 14 oC, με αργό πετρέλαιο (0,5% v/v) και θρεπτικά. Βιοεπιφανειοδραστική δράση ανιχνεύθηκε μετά από 9 ημέρες με ποιοτικές δοκιμές ανίχνευσης. Από τη διαδικασία απομόνωσης και κλασμάτωσης προέκυψαν γλυκολιπιδικές βιοεπιφανειοδραστικές ενώσεις, με απόδοση 41,3 mg L⁻¹ ραμνολιπιδίων (10 mg g⁻¹ προστιθέμενου πετρελαίου ή περίπου 1% w/w ως προς την αρχική ποσότητα πετρελαίου). Οι αναλύσεις TLC έδειξαν την παρουσία μονο- και δι-ραμνολιπιδικών κλασμάτων, η FTIR υποστήριξε τη γλυκολιπιδική φύση των απομονωμένων κλασμάτων, ενώ με αναλύσεις GC–MS προσδιορίστηκε το προφίλ των β-υδροξυ λιπαρών οξέων, το οποίο περιλάμβανε κορεσμένες αλυσίδες από C6:0 έως C18:0. Η ποσότητα των ραμνολιπιδίων που παράχθηκε ήταν θεωρητικά επαρκής για να καλύψει πλήρως σταγονίδια πετρελαίου με διάμετρο περίπου 1–2 μm, υποδηλώνοντας σημαντικό επιφανειοδραστικό δυναμικό υπό συνθήκες βαθιάς θάλασσας. Προσομοιώσεις υποθετικών υποθαλάσσιων διαρροών στην Ανατολική Μεσόγειο έδειξαν ότι η σύσταση των υδρογονανθράκων ήταν ο κύριος παράγοντας που έλεγχε την τύχη του πετρελαίου, υπερισχύοντας των επιδράσεων της εποχής, του ρυθμού διαρροής και της υποθαλάσσιας έγχυσης διασκορπιστικού. Προσομοιώθηκαν 64 σενάρια για τέσσερις τύπους διαρροής: ελαφρύ αργό πετρέλαιο (light crude oil, LC), ελαφρύ αργό πετρέλαιο με ταυτόχρονη απελευθέρωση αερίου (LC-G), συμπύκνωμα αερίου (gas condensate, GC) και συμπύκνωμα αερίου με ταυτόχρονη απελευθέρωση αερίου (GC-G). Στα σενάρια LC και LC-G, μεγαλύτερο μέρος του πετρελαίου παρέμεινε στην επιφάνεια και συνδέθηκε με μεγαλύτερη έκθεση της ακτογραμμής, ενώ τα σενάρια GC και GC-G οδήγησαν σε μεγαλύτερη παραμονή υδρογονανθράκων στη στήλη του νερού και δεν εμφάνισαν απόθεση στην ακτογραμμή στις προσομοιώσεις. Η πρωτογενής βιοαποδόμηση που υπολογίστηκε από το μοντέλο αποτέλεσε τη μεγαλύτερη συνιστώσα του ισοζυγίου μάζας και αυξήθηκε από 22,2% για το LC σε 43,0% για το LC-G, 60,5% για το GC και >80% για το GC-G. Η υποθαλάσσια έγχυση διασκορπιστικού είχε δευτερεύουσα και εξαρτώμενη από τον τύπο υδρογονάνθρακα επίδραση, μειώνοντας την παρουσία πετρελαίου στην επιφάνεια και αυξάνοντας την παραμονή υδρογονανθράκων στη στήλη του νερού. Οι εποχικές συνθήκες επηρέασαν κυρίως τη μεταφορά και την έκθεση της ακτογραμμής, με το καλοκαίρι να ευνοεί μεγαλύτερη παράκτια εναπόθεση και τον χειμώνα μεγαλύτερη διασπορά στην ανοιχτή θάλασσα. Η διατριβή δείχνει ότι η διατήρηση της υδροστατικής πίεσης είναι απαραίτητη για τη μελέτη της βιοαποδόμησης πετρελαϊκών υδρογονανθράκων υπό συνθήκες που προσεγγίζουν περισσότερο το φυσικό περιβάλλον της βαθιάς θάλασσας. Οι αυτόχθονες μικροβιακές κοινότητες της Ανατολικής Μεσογείου παρουσίασαν ισχυρή ικανότητα απομάκρυνσης υδρογονανθράκων υπό πίεση, αποκρίθηκαν κυρίως στη διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών κατά τα πειράματα βιοεξυγίανσης με αυξημένο πετρελαϊκό φορτίο και παρήγαγαν δομικά ποικίλα ραμνολιπίδια με πιθανό βιοτεχνολογικό δυναμικό. Η μοντελοποίηση έδειξε ότι οι συνέπειες μιας υπερβαθιάς υποθαλάσσιας διαρροής στην Ανατολική Μεσόγειο εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τη σύσταση των υδρογονανθράκων, με τα σενάρια αργού πετρελαίου να οδηγούν κυρίως σε επιφανειακή και παράκτια έκθεση, ενώ τα σενάρια συμπυκνώματος/αερίου οδηγούν κυρίως σε παραμονή των υδρογονανθράκων στη στήλη του νερού και σε υποεπιφανειακή έκθεση. Συνολικά, τα πειραματικά αποτελέσματα και οι προσομοιώσεις παρέχουν τεκμηριωμένη βάση για τη βελτίωση της αξιολόγησης υποθαλάσσιων διαρροών, της παραμετροποίησης της βιοαποδόμησης και του σχεδιασμού ετοιμότητας για περιστατικά ρύπανσης στην Ανατολική Μεσόγειο.