Σχεδιασμός και ανάπτυξη βιοαντιδραστηρίων κατάλληλων για την παραγωγή ή προσομοίωση δράσεων αντιοφικού ορού

Abstract

Venomous snakes constitute a major global public health concern, particularly in regions with a high incidence of snakebite envenoming and limited access to specialized medical care. Envenomation by members of the family Viperidae can induce severe local and systemic effects, including hemorrhage, tissue necrosis, neurotoxicity, myotoxicity, and hemostatic disturbances, often resulting in permanent disability or death. The primary therapeutic approach remains the administration of antivenoms, which are traditionally produced by immunizing large mammals with whole venom. However, conventional antivenoms present significant limitations, including high production costs, limited availability, and the risk of severe adverse reactions. Phospholipases A₂ (PLA₂s) represent one of the most important toxin families in viper venoms, as they are involved in multiple pathological mechanisms, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, and inflammatory responses. Their high biological relevance, combined with the presence of conserved regions among different viper species, makes them attractive molecular targets for the development of broad-spectrum, toxin-specific antibodies. Within this context, the aim of the present doctoral dissertation was the rational design, synthesis, and immunological evaluation of synthetic peptide epitopes derived from viper venom phospholipases A₂, with the objective of generating toxin-specific antibodies and exploring their future application either in the development of next generation antivenoms or in toxin-removal technologies for the extracorporeal treatment of envenomed patients. Initially, homology studies were conducted among PLA₂s from various viper species, followed by detailed comparisons between Vipera ammodytes ammodytes and Vipera berus berus PLA₂s, as well as with human PLA₂ homologues. The results revealed a high degree of sequence homology among viper PLA₂s (>60–70%) and low similarity to the corresponding human proteins (<35%), supporting the feasibility of selective immunological targeting with minimal risk of cross-reactivity against human PLA₂s. Subsequently, computational analyses of antigenicity, hydrophilicity, surface accessibility, flexibility, mobility, and secondary structure were performed to identify suitable linear B-cell epitopes. Based on these analyses, two peptide epitopes were selected for synthesis: D128FLCKKESEK137 from Ammodytoxin A of Vipera ammodytes and S128SNCQENSDK137 from the PLA₂ of Vipera berus. The peptides were synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS), purified by RP-HPLC, and characterized by mass spectrometry and NMR spectroscopy. The results confirmed the successful synthesis and high purity of both peptides, while NMR analysis indicated that they do not adopt a stable three-dimensional conformation in solution. To enhance immunogenicity, the peptides were conjugated to the synthetic peptide carrier CPSOC(3,9-Acm), which was appropriately modified to allow controlled attachment of the epitopes through a chemoselective thioether bond. This strategy led to the successful synthesis of the immunogenic constructs CPSOC(3,9-Acm;6,12-DFLC(Acm)KKESEK) and CPSOC(3,9-Acm;6,12-SSNC(Acm)QENSDK). These conjugates were subsequently used for chicken immunization, both individually and as a mixture, for the production of IgY antibodies. Chickens were selected for IgY antibody production due to the well-established advantages of IgY technology, including non-invasive antibody collection from egg yolks, high productivity, and a reduced likelihood of false-positive results in immunochemical assays. Antibodies were isolated using the polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) precipitation protocol, followed by purification through dialysis and affinity chromatography using Sepharose-based columns coupled with the synthetic epitopes. ELISA assays demonstrated the successful production of specific antibodies with satisfactory titers. Significantly higher antibody titers were obtained following immunization with the mixture of the two immunogens compared with single-immunogen immunization. Furthermore, immunized chickens continued to produce specific antibodies with satisfactory activity for up to eight months after the final immunization. Regarding storage stability, the lyophilized antibody preparations exhibited substantially greater stability than antibodies stored in solution. A particularly important finding was the ability of the generated antibodies to recognize not only the synthetic immunogens but also whole native viper venoms. Specifically, antibodies raised against both the individual immunogens and the immunogen mixture successfully recognized Vipera ammodytes venom. Moreover, antibodies generated against the immunogen mixture exhibited cross-reactivity with venoms from Montivipera xanthina and Macrovipera schweizeri, confirming both the accessibility and the high conservation of the selected epitopes within the corresponding phospholipases A₂. In conclusion, this dissertation demonstrates that the rational design of synthetic phospholipase A₂ peptide epitopes and their corresponding immunogenic constructs can lead to the generation of specific and functional antibodies capable of recognizing both homologous and heterologous viper venoms. Consequently, this strategy may provide the foundation for the development of next-generation antivenom-related tools characterized by lower production costs, higher specificity, and broader accessibility.

Τα δηλητηριώδη φίδια αποτελούν σημαντικό πρόβλημα για την δημόσια υγεία παγκοσμίως, ιδιαίτερα σε περιοχές με αυξημένη επίπτωση δηγμάτων και περιορισμένη πρόσβαση σε εξειδικευμένη ιατρική περίθαλψη. Ειδικότερα, τα δήγματα της οικογένειας Viperidae προκαλούν σοβαρές τοπικές και συστηματικές βλάβες, όπως αιμορραγίες, νέκρωση ιστών, νευροτοξικότητα, μυοτοξικότητα και διαταραχές της αιμόστασης, οδηγώντας συχνά σε μόνιμες αναπηρίες ή ακόμη και σε θάνατο. Η βασική θεραπευτική προσέγγιση παραμένει η χορήγηση αντιοφικών ορών, οι οποίοι παράγονται κυρίως μέσω ανοσοποίησης μεγάλων θηλαστικών με ολόκληρο δηλητήριο. Ωστόσο, οι συμβατικοί αντιοφικοί οροί παρουσιάζουν σημαντικούς περιορισμούς, όπως το υψηλό κόστος παραγωγής, η περιορισμένη διαθεσιμότητα, καθώς και η πιθανότητα σοβαρών ανεπιθύμητων αντιδράσεων. Οι φωσφολιπάσες Α₂ (PLA₂s) αποτελούν μία από τις σημαντικότερες οικογένειες τοξινών των εχιδνών, καθώς συμμετέχουν σε ποικίλους μηχανισμούς, όπως η νευροτοξικότητα, η μυοτοξικότητα, η κυτταροτοξικότητα και η φλεγμονώδης απόκριση. Η υψηλή βιολογική τους σημασία, σε συνδυασμό με τη διατήρηση συντηρημένων περιοχών μεταξύ διαφορετικών ειδών εχιδνών, τις καθιστούν ιδανικούς μοριακούς στόχους για την ανάπτυξη εξειδικευμένων αντισωμάτων ευρέος φάσματος. Στο πλαίσιο αυτό, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο ορθολογικός σχεδιασμός, η σύνθεση και η ανοσολογική αξιολόγηση συνθετικών πεπτιδικών επιτόπων προερχόμενων από φωσφολιπάσες Α₂ δηλητηρίων εχιδνών, με στόχο την παραγωγή εξειδικευμένων αντισωμάτων έναντι τοξινών και τη μελλοντική αξιοποίησή τους, είτε στην ανάπτυξη αντιοφικών ορών νέας γενιάς, είτε σε τεχνολογίες απομάκρυνσης τοξινών από το αίμα ασθενών. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ομολογίας μεταξύ των φωσφολιπασών Α₂ των ειδών της οικογένειας των εχιδνών και στη συνέχεια μεταξύ των ειδών Vipera ammodytes ammodytes και Vipera berus berus, καθώς και συγκρίσεις με ανθρώπινες φωσφολιπάσες Α₂. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλή ομολογία μεταξύ των φωσφολιπασών των εχιδνών (>60–70%) και χαμηλή ομολογία με τις αντίστοιχες ανθρώπινες πρωτεΐνες (<35%), γεγονός που υποστηρίζει τη δυνατότητα εκλεκτικής ανοσολογικής στόχευσης χωρίς σημαντική διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με ανθρώπινες PLA₂. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν υπολογιστικές μελέτες αντιγονικότητας, υδροφιλικότητας, επιφανειακής προσβασιμότητας, ευκαμψίας, ευελιξίας και δευτεροταγούς δομής, με σκοπό την επιλογή κατάλληλων γραμμικών Β-κυτταρικών επιτόπων. Από τις αναλύσεις αυτές επιλέχθηκαν δύο πεπτιδικοί επίτοποι προς σύνθεση: το πεπτίδιο D128FLCKKESEK137 από την Αμμοδυτοξίνη Α της Vipera ammodytes και το πεπτίδιο S128SNCQENSDK137 από τη φωσφολιπάση Α₂ της Vipera berus. Ακολούθως, τα πεπτίδια συντέθηκαν με τη μέθοδο στερεάς φάσης (SPPS), καθαρίστηκαν με RPHPLC και χαρακτηρίστηκαν με φασματομετρία μάζας και φασματοσκοπία NMR. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την επιτυχή σύνθεση και την υψηλή καθαρότητα των πεπτιδίων, ενώ η ανάλυση NMR έδειξε ότι δεν υιοθετούν σταθερή τρισδιάστατη διαμόρφωση σε διάλυμα. Για την ενίσχυση της ανοσογονικότητας, τα πεπτίδια συζεύχθηκαν με τον συνθετικό πεπτιδικό φορέα CPSOC(3,9-Acm), ο οποίος τροποποιήθηκε κατάλληλα ώστε να επιτρέπει ελεγχόμενη πρόσδεση των επιτόπων μέσω χημειοεκλεκτικού θειοαιθερικού δεσμού. Με τον τρόπο αυτό συντέθηκαν επιτυχώς τα αντίστοιχα ανοσογονικά συμπλέγματα CPSOC (3,9-Acm;6,12-DFLC(Acm)KKESEK) και CPSOC (3,9-Acm;6,12- SSNC(Acm)QENSDK) και ακολούθησαν ανοσοποιήσεις ορνίθων για την παραγωγή IgY αντισωμάτων, τόσο με μεμονωμένο ανοσογόνο όσο και με μίγμα των δύο ανοσογονικών συμπλεγμάτων. Η επιλογή των ορνίθων για την παραγωγή αντισωμάτων βασίστηκε στα σημαντικά πλεονεκτήματα της τεχνολογίας IgY, όπως η μη επεμβατική απομόνωση αντισωμάτων από τον κρόκο του αυγού, η υψηλή παραγωγικότητα και η μειωμένη πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων σε ανοσοχημικές δοκιμασίες. Η απομόνωση των αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε με το πρωτόκολλο της πολυαιθυλενογλυκόλης 6000, ενώ στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισμός με διαπίδυση και χρωματογραφία συγγένειας, με χρήση εξειδικευμένων στηλών σεφαρόζης στις οποίες είχαν προσδεθεί οι συντεθειμένοι επίτοποι. Οι ανοσοδοκιμασίες ELISA έδειξαν ότι παρήχθησαν εξειδικευμένα αντισώματα ικανοποιητικού τίτλου. Σαφώς υψηλότερο τίτλο εμφάνισαν τα αντισώματα στην περίπτωση ανοσοποίησης με το μίγμα των δύο ανοσογόνων έναντι της μονοδύναμης ανοσοποίησης. Επιπλέον, οι όρνιθες συνέχισαν να παράγουν εξειδικευμένα αντισώματα με ικανοποιητική δραστικότητα έως και οκτώ μήνες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, ενώ όσον αφορά την αποθήκευση τους η λυοφιλοποιημένη μορφή παρουσίασε σημαντικά καλύτερη σταθερότητα σε σύγκριση με την αποθήκευση σε διάλυμα. Ιδιαίτερα σημαντικό εύρημα αποτέλεσε η δυνατότητα των παραχθέντων αντισωμάτων να αναγνωρίζουν όχι μόνο τα συνθετικά ανοσογόνα αλλά και ολόκληρα φυσικά δηλητήρια εχιδνών. Συγκεκριμένα, τα αντισώματα τόσο έναντι του μεμονομένου ανοσογόνου όσο και του μίγματος αναγνώρισαν επιτυχώς το δηλητήριο της Vipera ammodytes. Επιπλέον τα παραχθέντα αντισώματα έναντι του μίγματος εμφάνισαν και διασταυρούμενη αντιδραστικότητα έναντι των δηλητηρίων των ειδών Montivipera xanthina και Macrovipera schweizeri, γεγονός που επιβεβαιώνει την προσβασιμότητα καθώς και την υψηλή συντήρηση των επιλεγμένων επιτόπων στις ντίστοιχες φωσφολιπάσες. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή αποδεικνύει ότι ο σχεδιασμός συνθετικών πεπτιδικών επιτόπων φωσφολιπασών Α₂ και κατά συνέπεια τα αντίστοιχα ανοσογονικά συμπλέγματα μπορούν να οδηγήσουν στην παραγωγή εξειδικευμένων και λειτουργικών αντισωμάτων με δυνατότητα αναγνώρισης ομόλογων και ετερόλογων δηλητηρίων εχιδνών. Κατά συνέπεια, η στρατηγική αυτή μπορεί να θέσει τις βάσεις για την ανάπτυξη εργαλείων νέας γενιάς, χαμηλότερου κόστους, υψηλότερης εξειδίκευσης και ευρύτερης διαθεσιμότητας.