Control of NF-κB DNA binding

Abstract

Many genes controlling cell cycle, immune responses, inflammation etc are regulated by the activation of NF-κB/Rel transcription factors. NF-κB is kept as an inactive cytoplasmic form due to its binding to IκB, and is induced by a series of extracellular stimuli. The mechanism of activation leads to the nuclear translocation of NF-κB, DNA binding and transactivation. The objectives of this work were to understand the molecular interactions which lead to the formation of NF-κB·DNA and NF-κB·IκB complexes, as well as to clarify the role of the controversial IκB molecule Bcl-3 in NF-κB driven transcription. More precisely, it was achieved to identify residues that play critical role in the stabilisation of the complexes mentioned above, whose role was not revealed by crystallographic analyses. A few independent lines of evidence lead us to investigate the hypothesis that a lysine residue, conserved among all NF-κB molecules and located in the tip of the C-terminal part of NF-κB p50 L1 loop, could interact with the phosphate bacκBone of the DNA target and with the C-terminus of the ankyrin repeat domain of IκBγ. For that reason, 6 p50 mutants were constructed where the three neighbouring lysine residues (K77, K79 and K80) of L1 loop C-terminus were mutated to alanines. The binding activity of the wild type and the mutants was tested by Surface Plasmon Resonance analysis. What was revealed is that K80 is critical for the interaction of p50 with both its DNA target and its protein inhibitor IκBγ. K80 stabilises p50·DNA complex and together with K77, it interacts with IκBγ leading to the dissociation of the p50·DNA complex. The mechanisms of NF-κB·IκB binding and those which play a role in the inhibition of NF-κB DNA binding were also investigated. We demonstrated that Bcl-3 effectively interacts with p50 through p50 NLS, that the ankyrin repeat 6 of IκBα effectively interacts with p65 and that p50 K77 and K80 interact with IκBγ. Finally, we showed how Bcl-3 can repress/co-activate via p50 in a DNA sequence specific way and we proposed a mechanism for IκB-driven NF-κB DNA binding inhibition.

Πολλά γονίδια που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο, τις ανοσολογικές αντιδράσεις, τη φλεγμονή κ.λπ. ρυθμίζονται μέσω της ενεργοποίησης των μεταγραφικών παραγόντων NF-κB/Rel. Το NF-κB διατηρείται σε ανενεργή κυτταροπλασματική μορφή λόγω της προσδεσής του στο IκB και ενεργοποιείται από μια σειρά εξωκυτταρικών ερεθισμάτων. Ο μηχανισμός ενεργοποίησης οδηγεί στη μετατόπιση του NF-κB στον πυρήνα, στη πρόσδεσή του στο DNA και στη trans-ενεργοποίηση. Στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν η κατανόηση των μοριακών αλληλεπιδράσεων που οδηγούν στον σχηματισμό των συμπλεγμάτων NF-κB·DNA και NF-κB·IκB, καθώς και η αποσαφήνιση του ρόλου του αμφιλεγόμενου μορίου IκB Bcl-3 στη μεταγραφή που ρυθμίζεται από τον NF-κB. Πιο συγκεκριμένα, επιτεύχθηκε η ταυτοποίηση αμινοξέων που διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη σταθεροποίηση των προαναφερθέντων συμπλεγμάτων, ο ρόλος των οποίων δεν είχε αποκαλυφθεί από κρυσταλλογραφικές αναλύσεις. Διάφορες ανεξάρτητες ενδείξεις μας οδήγησαν να διερευνήσουμε την υπόθεση ότι ένα κατάλοιπο λυσίνης, το οποίο είναι συντηρημένο σε όλα τα μόρια NF-κB και βρίσκεται στο καρβοξυτελικό τμήμα του βρόχου L1 του NF-κB p50, θα μπορούσε να αλληλεπιδράσει με την σπονδυλική στήλη φωσφορικών του DNA-στόχου και με το καρβοξυτελικό άκρο της περιοχής επαναλήψεων αγκυρίνης του IκBγ.Για τον λόγο αυτό, κατασκευάστηκαν 6 μεταλλαγές του p50, στις οποίες τα τρία γειτονικά κατάλοιπα λυσίνης (K77, K79 και K80) του καρβοξυτελικού άκρου του βρόχου L1 μεταλλάχθηκαν σε αλανίνες. Η δραστικότητα πρόσδεσης του φυσιολογικού τύπου και των μεταλλάξεων εξετάστηκε με ανάλυση συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων. Αποκαλύφθηκε ότι η θέση K80 είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση της p50 τόσο με τον στόχο της στο DNA όσο και με τον πρωτεϊνικό αναστολέα της, το IκBγ. Η θέση K80 σταθεροποιεί το σύμπλεγμα p50·DNA και, μαζί με την θέση K77, αλληλεπιδρά με το IκBγ, οδηγώντας στη διάσπαση του συμπλέγματος p50·DNA. Διερευνήθηκαν επίσης οι μηχανισμοί σύνδεσης του NF-κB με το IκB, καθώς και εκείνοι που παίζουν ρόλο στην αναστολή της σύνδεσης του NF-κB με το DNA. Αποδείξαμε ότι η Bcl-3 αλληλεπιδρά αποτελεσματικά με την p50 μέσω της NLS της p50, ότι η επανάληψη αγκυρίνης 6 της IκBα αλληλεπιδρά αποτελεσματικά με την p65 και ότι τα K77 και K80 της p50 αλληλεπιδρούν με την IκBγ. Τέλος, δείξαμε πώς το Bcl-3 μπορεί να καταστέλλει ή να συνενεργοποιεί μέσω του p50 με τρόπο ειδικό για κάθε αλληλουχία DNA και προτείναμε έναν μηχανισμό για την αναστολή της πρόσδεσης του NF-κB στο DNA που προκαλείται από το IκB.