Συμβίωση, δυσβίωση και αναβίωση στον εντερικό σωλήνα του εδώδιμου χερσαίου σαλιγκαριού Cornu aspersum maxima

Abstract

The intestinal microbiota plays a crucial role in maintaining gastrointestinal homeostasis by preserving the structural and functional integrity of the gastrointestinal tract and by carrying out essential metabolic processes. These include the degradation of complex dietary components that cannot be digested by the host’s enzymes and the synthesis of essential metabolites, such as vitamin K and certain B vitamins. However, the balance of the intestinal microflora is susceptible to both genetic and environmental factors, including infectious and toxic agents. Disruptions of this homeostasis leads to dysbiosis, a condition associated with immunological, metabolic, and infectious disorders. The restoration of microbial balance, a process known as rebiosis, can be achieved through the targeted administration of probiotics with antibacterial and immunomodulatory effects. Even though we have managed to improve our understanding of the intestinal microflora-immune responses interactions in vertebrates, the level of knowledge for invertebrates, specifically for terrestrial gastropods such as the snail Cornu aspersum maxima, remains limited. Few studies have examined the functionality of probiotics in terrestrial gastropods, mainly focusing on the genus Lactiplantibacillus, while the genus Enterococcus, although a natural member of the intestinal microflora of snails, remains largely unexplored. At the same time, the contribution of bacterial pathogens to snail dysbiosis has been investigated to a very limited extent, with international literature focusing mainly on parasitic organisms. Therefore, this research gap highlights the need for further investigation into the mechanisms of innate immunity and their relationship with probiotic and pathogenic microorganisms, which constitute the objective of the present doctoral dissertation. In this context, the present thesis focused on the isolation and molecular identification of microorganisms from the intestinal tract of C. aspersum maxima, as well the investigation of their interactions with the host and innate defense mechanisms in symbiotic, dysbiotic and rebiotic conditions. In total, 12 lactic acid bacterial strains were isolated. These were evaluated for their ability to resist the snail’s natural and chemical defense barriers (pedal and gastric mucus, acidic gastric conditions), the presence of cell surface characteristics associated with successful gastrointestinal colonization (cell surface hydrophobicity, biofilm formation, autoaggregation), and their immunomodulatory abilities. For the selection and the subsequent in vivo examination of the most promising probiotic strains, a revolutionary machine learning (ML) model was utilized. Based on the results of the decision tree, 10 strains had a 100% probability of inducing immunomodulatory activity in vivo. Out of those, the strains L. plantarum Spp1, Spp11 and E. faecalis Spp3, Spp8, Spp19 were selected for in vivo evaluation of their probiotic abilities. The results demonstrated strain-specific activation of cellular and/or humoral immune responses and identified L. plantarum Spp11 and E. faecalis Spp19 as safe probiotics with strong immunomodulatory capabilities. L. plantarum Spp11 significantly enhanced amoebocytes chemotaxis, phagocytic activity, and the bactericidal capacity of the hemolymph, without inducing inflammatory or histological alterations, highlighting its strong immunomodulatory and protective potential. E. faecalis Spp19 moderately activated cellular immune responses of the snails’ innate immune system without disrupting host homeostasis and histological integrity. Both strains demonstrated a strong ability to overcome the host’s natural defense barriers and adhere to the snail’s intestinal epithelium, thereby confirming their functional probiotic role in vivo.Additionally, for the first time, the virulence of potentially pathogenic Pseudomonas strains was investigated for snails. A total of 28 strains of the genus Pseudomonas were isolated from snails sourced from a high-mortality farm. Twelve of these strains (1, 2, 8, 10, 11, 15, 21, 23, 6A, 7A, 8A, 9A) exhibited strong biofilm-forming ability, autoaggregation and surface hydrophobicity, traits that enhance their ability to adhere to the intestinal epithelium of snails. Furthermore, they demonstrated significant resistance to components of the host’s natural defense barriers, including the hemolymph, which has strong antimicrobial activity. For the first time in snails, molecular identification revealed the presence of the species P. putida (2, 8, 10, 11, 21, 23, 6A, 8A, 9A), P. fulva (1, 15) and P. baetica 7A. Among the isolated strains, P. putida 6A and P. baetica 7A were identified as the most virulent, inducing high mortality and strong inflammatory cellular responses, with an increase in amoebocytes, hyalinocytes and dead cells, as well as intense oxidative stress characterized by activation of the phenoloxidase pathway and increased production of nitric oxide (NO-) and reactive oxygen species (ROS). Significant differences in immune responses were observed among the two administration methods of these strains, with oral administration causing substantially lower mortality rates compared to injection-based administration. P. baetica 7A exhibited higher pathogenicity than P. putida 6A, which was associated with more intense inflammatory cellular and humoral responses, suppression of phagocytosis via secreted factors, disruption of intestinal microflora, and extensive histological lesions. Furthermore, an elevated production of mucus was noted in the intestinal epithelium, accompanied by enhanced mucus and calcium cells release through the feces. The calcium loss was associated with reduced calcium deposits in the hepatopancreas, probably due to the extensive histological lesions in that organ.In this thesis, a dysbiosis-rebiosis animal model was established for the first time in C. aspersum maxima, using controlled administration of two pathogenic and two probiotic microorganisms. The combination of the virulent P. baetica 7A and the hypervirulent strain L. monocytogenes SN3 caused mortality of more than 50%, accompanied by severe inflammatory cellular and humoral responses, as well as extensive histological lesions. Oral administration of the probiotic L. plantarum Spp11 inhibited the development of the above clinicopathological features associated with P. baetica 7A-induced dysbiosis, thereby contributing effectively to host rebiosis. Additionally, administration of a probiotic cocktail (L. plantarum Spp11 and Sgs14) alongside both pathogens demonstrated a strong protective and inhibitory effect against pathogenesis, significantly reducing mortality and restoring immune responses and tissue morphology to normal levels, thereby re-establishing intestinal homeostasis. Overall, this thesis provides new data on the complex interactions between probiotic and pathogenic bacterial strains and the innate immune system of snails. The findings support the application of probiotics as functional feed additives aimed at improving the health, resilience and well-being of farmed snails. Notably, this is the first study to identify the genus Pseudomonas as a snail pathogen. Although less virulence than the hypervirulent L. monocytogenes, Pseudomonas poses a significant risk to snail farming systems due to its ability to remain undetected while progressively compromising animal health and, consequently, the quality of the resulting products, raising potential concerns for public health and food safety. Finally, this thesis reinforces the role of C. aspersum maxima as a reliable and versatile invertebrate model for the in vivo study of probiotic and pathogenic bacteria, highlighting dorsal hemocoel administration as a powerful tool for the rapid and reliable pre-selection of bacterial strains with immunomodulatory activity, and offering new perspectives for applied research in invertebrate breeding and immunobiology.

Ο εντερικός μικροβιόκοσμος διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του γαστρεντερικού σωλήνα, ενισχύοντας τη δομική και λειτουργική ακεραιότητα του, καθώς επιτελεί μεταβολικές διεργασίες που οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί δεν μπορούν να εκτελέσουν αυτόνομα. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν η αποδόμηση σύνθετων συστατικών που δεν πέπτονται από τα ένζυμα του ξενιστή, καθώς και η σύνθεση απαραίτητων μεταβολιτών, όπως η βιταμίνη Κ και ορισμένες βιταμίνες του συμπλέγματος Β. Η ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας είναι ευάλωτη τόσο σε γενετικούς όσο και περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως μολυσματικοί και τοξικοί παράγοντες. Η διατάραξη της ομοιόστασης οδηγεί σε δυσβίωση, μια κατάσταση που σχετίζεται με ανοσολογικές, μεταβολικές και μολυσματικές διαταραχές. Η αναβίωση, δηλαδή η αποκατάσταση της μικροβιακής ισορροπίας, είναι δυνατό να επιτευχθεί μέσω της στοχευμένης χορήγησης προβιοτικών με αντιβακτηριακή και ανοσοτροποποιητική δράση. Παρά το γεγονός ότι η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων εντερικής μικροχλωρίδας-ανοσοποιητικού έχει προχωρήσει σημαντικά στα σπονδυλωτά, τα αντίστοιχα δεδομένα για τα ασπόνδυλα και ειδικά για τα χερσαία γαστερόποδα όπως τα σαλιγκάρια Cornu aspersum maxima, παραμένουν περιορισμένα. Ελάχιστες έρευνες έχουν εξετάσει τη λειτουργικότητα των προβιοτικών σε χερσαία γαστερόποδα, με τις περισσότερες να επικεντρώνονται στο γένος Lactiplantibacillus, ενώ το γένος Enterococcus, παρότι αποτελεί φυσικό μέλος της εντερικής μικροχλωρίδας των σαλιγκαριών, παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητο. Παράλληλα, η συμβολή βακτηριακών παθογόνων στη δυσβίωση των σαλιγκαριών έχει ερευνηθεί σε πολύ περιορισμένο βαθμό, με τη διεθνή βιβλιογραφία να επικεντρώνεται κυρίως σε παρασιτικούς οργανισμούς. Το ερευνητικό αυτό κενό καθιστά αναγκαία την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών έμφυτης ανοσίας και της σχέσης τους με προβιοτικούς και παθογόνους μικροοργανισμούς, στόχος της οποίας αποτελεί η παρούσα διδακτορική διατριβή. Στο πλαίσιο αυτό, πιο συγκεκριμένα, η παρούσα διατριβή εστίασε στην απομόνωση και στη μοριακή ταυτοποίηση μικροοργανισμών από τον εντερικό σωλήνα του C. aspersum maxima και τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων τους με τον ξενιστή και τους έμφυτους μηχανισμούς άμυνας σε συνθήκες συμβίωσης, δυσβίωσης και αναβίωσης. Συνολικά απομονώθηκαν 12 στελέχη γαλακτικών βακτηρίων. Τα στελέχη διερευνήθηκαν ως προς την αντοχή τους στους φυσικούς και χημικούς αμυντικούς φραγμούς των σαλιγκαριών (εξωτερική βλέννα, γαστρική βλέννα και όξινα γαστρικά οξέα) και την παρουσία ιδιοτήτων της κυτταρικής επιφάνειας (υδροφοβία κυτταρικής επιφάνειας, ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου και αυτοσυσσωμάτωσης) που σχετίζονται με την ικανότητα αποικισμού του γαστρεντερικού σωλήνα και την ανοσοτροποποιητική τους ικανότητα. Για την επιλογή και περαιτέρω in vivo διερεύνηση των πιο υποσχόμενων προβιοτικών στελεχών, χρησιμοποιήθηκε ένα καινοτόμο μοντέλο μηχανικής μάθησης (ML). Με βάση τα αποτελέσματα του δέντρου απόφασης (decision tree) προβλέφθηκε ότι 10 στελέχη είχαν 100% πιθανότητα να προκαλέσουν ανοσοτροποποιητική δράση in vivo. Από αυτά, τα στελέχη L. plantarum Spp1, Spp11 και E. faecalis Spp3, Spp8, Spp19 επιλέχθηκαν για περαιτέρω in vivo αξιολόγηση των προβιοτικών ιδιοτήτων τους. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν στελεχική εξειδίκευση στην επαγωγή κυτταρικών και/ή χυμικών ανοσαποκρίσεων, με το L. plantarum Spp11 και το E. faecalis Spp19 να επιβεβαιώνονται ότι είναι ασφαλή για τη χρήση τους ως προβιοτικά με ισχυρή ανοσοενισχυτική δράση. Το L. plantarum Spp11 ενίσχυσε τη χημειόταξη των αμοιβαδοκυττάρων και τη φαγοκυτταρική τους δραστηριότητα, καθώς και τη βακτηριοκτόνο δράση της αιμολέμφου, χωρίς να προκαλέσει φλεγμονώδεις ή ιστολογικές αλλοιώσεις, αναδεικνύοντας ισχυρή ανοσοτροποποιητική και προστατευτική δράση. Το E. faecalis Spp19 ενεργοποίησε ηπιότερα τις κυτταρικές αποκρίσεις του έμφυτου μηχανισμού άμυνας των σαλιγκαριών, χωρίς να διαταράσσει την ομοιόσταση του ξενιστή και την ιστολογική ακεραιότητα. Και τα δύο στελέχη ξεχώρισαν για την ικανότητα τους να υπερβαίνουν τους φυσικούς αμυντικούς φραγμούς και να προσκολλώνται στο εντερικό επιθήλιο των σαλιγκαριών, επιβεβαιώνοντας τον προβιοτικό τους ρόλο in vivo.Επιπλέον, για πρώτη φορά διερευνήθηκε η λοιμογόνος δράση δυνητικά παθογόνων στελεχών μικροοργανισμών του γένους Pseudomonas στα σαλιγκάρια. Συνολικά απομονώθηκαν 28 βακτηριακά στελέχη του γένους Pseudomonas από σαλιγκάρια προερχόμενα από εκτροφείο με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Δώδεκα από αυτά (1, 2, 8, 10, 11, 15, 21, 23, 6Α, 7Α, 8Α, 9Α) παρουσίασαν υψηλή ικανότητα σχηματισμού βιοϋμένιου, αυτοσυσσωμάτωσης και επιφανειακής υδροφοβίας, χαρακτηριστικά που ενισχύουν την ικανότητα προσκόλλησής τους στο εντερικό επιθήλιο των σαλιγκαριών. Ταυτόχρονα, παρουσίασαν σημαντική ανθεκτικότητα στα συστατικά των φυσικών αμυντικών φραγμών, συμπεριλαμβανομένης της αιμολέμφου, η οποία διαθέτει ισχυρή αντιβακτηριακή δράση. Η μοριακή ταυτοποίηση ανέδειξε, για πρώτη φορά σε σαλιγκάρια, την παρουσία των ειδών P. putida (2, 8, 10, 11, 21, 23, 6A, 8A, 9A), P. fulva (1, 15) και P. baetica 7A. Μεταξύ αυτών, τα P. putida 6A και P. baetica 7A αναγνωρίστηκαν ως τα πλέον λοιμογόνα, προκαλώντας αυξημένη θνησιμότητα και ισχυρές φλεγμονώδεις κυτταρικές αποκρίσεις, με αύξηση των αμοιβαδοκυττάρων, των υαλινοκυττάρων και των νεκρών κυττάρων, καθώς και έντονη οξειδωτική καταπόνηση με ενεργοποίηση του μονοπατιού της φαινολοξειδάσης, αυξημένη παραγωγή νιτρικών (NO-) και δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Η χορήγηση τους μέσω της τροφής ανέδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις στις ανοσοαποκρίσεις, οδηγώντας σε σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά θνησιμότητας σε σύγκριση με την ενέσιμη χορήγηση. Το P. baetica 7A παρουσίασε ισχυρότερη παθογένεια από το P. putida 6A, η οποία συσχετίστηκε με πιο ισχυρές φλεγμονώδεις κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις, καταστολή της φαγοκυττάρωσης μέσω εκκρινόμενων παραγόντων, απορρύθμιση της εντερικής μικροχλωρίδας και εμφάνιση εκτεταμένων ιστολογικών αλλοιώσεων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αυξημένη παραγωγή βλέννας, στο εντερικό επιθήλιο, συνοδευόμενη από αυξημένη αποβολή βλέννας και ασβεστοκυττάρων μέσω των κοπράνων. Η αυξημένη αποβολή ασβεστοκυττάρων συσχετίστηκε με τη μείωση των αποθέσεων ασβεστίου στο ηπατοπάγκρεας, πιθανότατα ως συνέπεια των εκτεταμένων ιστολογικών αλλοιώσεων στον συγκεκριμένο ιστό. Για πρώτη φορά αναπτύχθηκε ζωικό μοντέλο δυσβίωσης και αναβίωσης στο C. aspersum maxima, μέσω της χορήγησης δύο παθογόνων και δύο προβιοτικών μικροοργανισμών. Ο συνδυασμός του λοιμογόνου P. baetica 7A με το υπερλοιμογόνο στέλεχος L. monocytogenes SN3 προκάλεσε θνησιμότητα άνω του 50%, συνοδευόμενη από έντονες φλεγμονώδεις κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις, καθώς και εκτεταμένες ιστολογικές αλλοιώσεις. Η χορήγηση του προβιοτικού L. plantarum Spp11 ανέστειλε την εμφάνιση των παραπάνω κλινικοπαθολογικών συμπτωμάτων που σχετίζονται με την P. baetica 7A-επαγόμενη δυσβίωση, συμβάλλοντας αποτελεσματικά στην αναβίωση των σαλιγκαριών. Παράλληλα, η χορήγηση του κοκτέιλ προβιοτικών στελεχών L. plantarum Spp11 και Sgs14 με τα δύο παθογόνα ανέδειξε ισχυρή προστατευτική και ανασταλτική δράση έναντι της παθογένειας, μειώνοντας σημαντικά τη θνησιμότητα και αποκαθιστώντας τόσο τις ανοσοαποκρίσεις όσο και τη μορφολογία των ιστών σε φυσιολογικά επίπεδα, επαναφέροντας την εντερική ομοιόσταση. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρουσιάζει νέα δεδομένα σχετικά με τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προβιοτικών και παθογόνων βακτηριακών στελεχών και του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος των σαλιγκαριών. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την αξιοποίηση των προβιοτικών ως λειτουργικά πρόσθετα ζωοτροφών, με στόχο τη βελτίωση της υγείας, της ανθεκτικότητας και της ευζωίας των εκτρεφόμενων σαλιγκαριών. Παράλληλα, για πρώτη φόρα αναδεικνύεται το γένος Pseudomonas ως παθογόνο των σαλιγκαριών, το οποίο, αν και εμφανίζει μικρότερη λοιμογόνο δράση συγκριτικά με το υπερλοιμογόνο L. monocytogenes, ενέχει ιδιαίτερο κίνδυνο για τα συστήματα σαλιγκαροτροφίας. Η ικανότητα του να παραμένει μη ανιχνεύσιμο, υποβαθμίζοντας ωστόσο την υγεία των ζώων και κατά συνέπεια την ποιότητα των παραγόμενων προϊόντων, εγείρει σημαντικούς προβληματισμούς για τη δημόσια υγεία και την ασφάλεια των τροφίμων. Τέλος, η διατριβή ενισχύει την άποψη ότι το C. aspersum maxima αποτελεί ένα αξιόπιστο και πολυδύναμο οργανισμό μοντέλο για την in vivo διερεύνηση προβιοτικών και παθογόνων βακτηρίων σε ασπόνδυλα, αναδεικνύοντας τη χορήγηση στο ραχιαίο αιμόκοιλο ως ένα ισχυρό εργαλείο για ταχεία και αξιόπιστη προεπιλογή στελεχών με ανοσοτροποποιητική δράση, προσφέροντας νέες προοπτικές για την εφαρμοσμένη έρευνα στην εκτροφή και την ανοσοβιολογία των ασπόνδυλων οργανισμών.