Φυτοπαθολογική και μοριακή διερεύνηση των ασθενειών του ξύλου της αμπέλου

Abstract

Grapevine trunk diseases represent the most significant problem in viticulture worldwide. The most important diseases include esca, Petri disease, and black foot disease. The combination of the latter two leads to the manifestation of young grapevine decline (YGD), which occurs both in propagation material and in young vines. Over the past three decades, a sharp increase in YGD has been observed, likely due to the uncontrolled movement of infected propagation material, the mechanization of propagation processes, and the cultural practices applied to mother vines. Because of the complexity of these diseases, the association of a large number of phylogenetically unrelated fungi, and the limited management measures available, their control remains particularly challenging. The aim of this dissertation was to study the epidemiology of pathogens associated with Petri disease and to investigate the contribution of emerging pathogens to grapevine trunk diseases. Particular emphasis was placed on the effect of propagation practices on the grapevine endophytic microbiome, examining both pathogenic and beneficial microorganisms and their interactions, with the goal of identifying critical stages of production with the greatest negative impact on cuttings. Finally, the last two chapters focused on the development of a mitigation strategy based on the biological control of the pathogen Phaeomoniella chlamydospora. Initially, a study was conducted on the distribution of Petri disease associated pathogens (P. chlamydospora and Phaeoacremonium minimum) along canes from different rootstocks over three consecutive years, using sensitive molecular techniques. Overall, inoculum levels were significantly lower at the distal part of the canes compared to the basal part, while clones of rootstocks 1103 Paulsen and Ruggeri 140 showed a notable level of tolerance to both pathogens. Furthermore, during a three-year experiment involving the elimination of infected mother vines (rootstock Richter 110), inoculum reduction in the mother vineyard reached approximately 90% for P. chlamydospora and 23% for P. minimum. These findings suggest that the removal of infected vines, combined with targeted harvesting of pathogen-free canes and the use of tolerant or resistant rootstocks, can mitigate infections by initiating propagation with healthy mother material. The contribution of the genus Diaporthe to wood diseases was also investigated. Extensive phylogenetic analysis confirmed the presence of five Diaporthe species in propagation material: D. ampelina, D. eres, D. foeniculina, D. serafiniae, and D. novem. Pathogenicity tests revealed that the first two species were the most aggressive on grapevine, with significant differences in symptom expression compared to the others. All species, except D. ampelina (former Phomopsis viticola), were identified for the first time as grapevine pathogens in Greece, although some have already been reported as pathogens in other countries. Epidemiological studies using the developed molecular diagnostic tool confirmed their presence in mother vines, highlighting their ability to survive in nurseries and contribute to subsequent infections in grafted rooted vines. Moreover, the negative correlation between their biomass in canes and symptom expression underscores the importance of early detection of latent infections to avoid the use of contaminated mother material. The extensive microbiome analysis that followed showed that propagation practices favor the development of all wood-invading pathogens while limiting the survival of beneficial bacteria, fungi, and yeasts. This was further confirmed by differential abundance analysis, where taxonomic units likely to play a role in the development of trunk diseases at the final product, were identified. Co-occurrence network analysis revealed the negative correlation of beneficial microorganisms such as the genus Aureobasidium and Acinetobacter with Cadophora luteo-olivacea, a fungus implicated in Petri disease. Based on these findings, a management strategy for P. chlamydospora in nurseries was developed, relying on the use of an endophytic bacterium Bacillus halotolerans ba4, isolated from the roots of phenotypically healthy mature vines. Its evaluation was carried out through in vitro, greenhouse, and field experiments, while its mode of action was also investigated. Although B. halotolerans ba4 inhibited the in vitro pathogen growth at a low rate, it reduced disease levels in greenhouse experiments by approximately 34% and 57% in artificially and naturally infected plants, respectively. In artificially infected cuttings, brown discoloration was reduced by 42%, while pathogen DNA levels decreased by about 76% and 33% in artificially and naturally infected cuttings, respectively. Similarly, field application of ba4 reduced vascular discoloration by 26% and pathogen biomass by 85%. In addition, young vines treated with ba4 showed increased net weight of roots and shoots by 45% and 43%, respectively, while defense-related genes were overexpressed in the presence of ba4 and the pathogen. Genome sequencing of ba4 revealed gene clusters associated with the biosynthesis of secondary metabolites with antimicrobial properties. Furthermore, experiments with the biological control agent Trichoderma harzianum T22 confirmed its biocontrol activity, reducing disease by approximately 62%, while also demonstrating its ability to colonize grapevine roots and promote growth. RNA sequencing (RNA-Seq) showed that T22 contributes to plant priming, as strong activation of defense mechanisms was observed in the presence of the pathogen. The results of this dissertation, if properly applied in viticultural practice, represent strategies that can be adopted by grapevine nurseries and potentially contribute to the mitigation of infections in propagation material caused by wood-invading pathogens.

Οι ασθένειες του ξύλου της αμπέλου αποτελούν το σημαντικότερο πρόβλημα της αμπελοκαλλιέργειας ανά τον κόσμο. Οι πιο σημαντικές ασθένειες αναφέρονται στην ίσκα, καθώς και στις ασθένειες του Petri και ασθένεια της μαύρης ρίζας (black foot disease). Ο συνδυασμός των δύο τελευταίων οδηγεί στην εκδήλωση του συνδρόμου της παρακμής των νεαρών πρέμνων (young grapevine decline, YGD), το οποίο παρατηρείται στο πολλαπλασιαστικό υλικό και σε νεαρά πρέμνα. Τις τελευταίες τρεις δεκαετίες, έχει παρατηρηθεί ραγδαία έξαρση του συνδρόμου YGD, η οποία πιθανά οφείλεται στην αλόγιστη και μη ελεγχόμενη μετακίνηση μολυσμένου πολλαπλασιαστικού υλικού, στην εκμηχάνιση της διαδικασίας του πολλαπλασιασμού αλλά και στις καλλιεργητικές πρακτικές που εφαρμόζονται στα μητρικά πρέμνα. Λόγω της πολυπλοκότητας αυτών των ασθενειών, της εμπλοκής ενός μεγάλου αριθμού φυλογενετικά μυ-συγγενικών μυκήτων σε αυτές, αλλά και των περιορισμένων μέτρων για τη διαχείρισή τους, η αντιμετώπιση αυτών των παθογόνων καθίσταται ιδιαίτερα δύσκολη. Αντικείμενο της παρούσας διατριβής, αποτέλεσε η μελέτη της επιδημιολογίας των παθογόνων που σχετίζονται με την ασθένεια του Petri και η μελέτη της συμβολής αναδυόμενων παθογόνων στην εκδήλωση των ασθενειών του ξύλου. Επιπλέον, δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στην μελέτη της επίδρασης της διαδικασίας πολλαπλασιασμού στο ενδοφυτικό μικροβίωμα της αμπέλου, εξετάζοντας τόσο τους παθογόνους, όσο και τους ωφέλιμους μικροοργανισμούς και της αλληλεπίδρασής τους, με στόχο την ταυτοποίηση των κρίσιμων σταδίων της παραγωγής με τη μεγαλύτερη αρνητική επίδραση στα μοσχεύματα. Τέλος, τα τελευταία δύο κεφάλαια αφιερώθηκαν στην ανάπτυξη μίας στρατηγικής μετριασμού των μολύνσεων με βάση τη βιολογική αντιμετώπιση του παθογόνου μύκητα P. chlamydospora. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μελέτη που αφορούσε στην κατανομή των παθογόνων της ασθένειας του Petri (Phaeomoniella chlamydospora και Phaeoacremonium minimum) κατά μήκος κληματίδων προερχόμενων από διαφορετικά υποκείμενα, σε τρία συναπτά έτη, με τη χρήση ευαίσθητων μοριακών τεχνικών. Συνολικά, βρέθηκε ότι το ποσοστό του μολύσματος στο ακραίο τμήμα των κληματίδων ήταν σημαντικά χαμηλότερο σε σχέση με το τμήμα της βάσης, ενώ φάνηκε ότι οι κλώνοι των υποκειμένων 1103 Paulsen και Ruggeri 140 παρουσιάζουν ένα σημαντικό επίπεδο ανοχής στα δύο παθογόνα. Επιπλέον, κατά τον τριετή πειραματισμό που αφορούσε στην καταστροφή των προσβεβλημένων μητρικών πρέμνων (υποκείμενο Richter 110), παρατηρήθηκε μείωση του μολύσματος στη μητρική φυτεία η οποία έφτανε περίπου το 90% για το μύκητα P. chlamydospora και περίπου 23% για το μύκητα P. minimum. Τα παραπάνω υποδεικνύουν ότι η καταστροφή των προσβεβλημένων πρέμνων σε συνδυασμό με την στοχευμένη συγκομιδή κληματίδων απαλλαγμένων από παθογόνα και τη χρήση ανεκτικών ή ανθεκτικών υποκειμένων, μπορεί να μετριάσει τις μολύνσεις, ξεκινώντας τη διαδικασία του πολλαπλασιασμού με υγιές μητρικό υλικό. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η συμβολή του γένους Diaporthe στην εκδήλωση ασθενειών του ξύλου. Η εκτενής φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, επιβεβαίωσε την παρουσία πέντε ειδών Diaporthe στο πολλαπλασιαστικό υλικό, ονόματι D. ampelina, D. eres, D. foeniculina, D. serafiniae και D. novem. Σύμφωνα με τις δοκιμές παθογένειας, τα δύο πρώτα είδη χαρακτηρίστηκαν ως τα πιο επιθετικά στην άμπελο, με σημαντική διαφοροποίηση των εκδηλωμένων συμπτωμάτων σε σύγκριση με τα υπόλοιπα. Όλα τα είδη εκτός του D. ampelina (πρώην Phomopsis viticola), βρέθηκαν για πρώτη φορά ως παθογόνα της αμπέλου στην Ελλάδα, ενώ κάποια από αυτά έχουν ήδη χαρακτηριστεί ως παθογόνα σε διαφορετικές χώρες του κόσμου. Η μελέτη της επιδημιολογίας τους με βάση το μοριακό διαγνωστικό εργαλείο που αναπτύχθηκε, επιβεβαίωσε την παρουσία τους στα μητρικά πρέμνα των υποκειμένων, κάτι το οποίο αναδεικνύει την ικανότητα τους να επιβιώνουν στο φυτώριο και να σχετίζονται με τις επικείμενες μολύνσεις στο τελικό προϊόν. Επιπροσθέτως, η αρνητική συσχέτιση της βιομάζας τους στις κληματίδες με την εκδήλωση συμπτωμάτων, υποδηλώνουν τη σημαντικότητα της έγκαιρης διάγνωσης των λανθανόντων μολύνσεων για την αποφυγή της χρησιμοποίησης μολυσμένου μητρικού υλικού. Η εκτενής ανάλυση του μικροβιώματος που ακολούθησε, έδειξε ότι η διαδικασία του πολλαπλασιασμού ευνοεί την ανάπτυξη όλων των παθογόνων ξύλου, ενώ φάνηκε να περιορίζει την επιβίωση ωφέλιμων βακτηρίων, μυκήτων και ζυμών. Αυτό επιβεβαιώθηκε και περαιτέρω με ανάλυση της διαφορικής αφθονίας (differential abundance), όπου ταυτοποιήθηκαν ταξινομικές μονάδες που πιθανά διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση των ασθενειών του ξύλου στο τελικό προϊόν. Περαιτέρω ανάλυση δικτύου συνήπαρξης (co-occurrence network analysis), έδειξε την αρνητική συσχέτιση συγκεκριμένων ταξινομικών μονάδων όπως τα γένη Aureobasidium και Acinetobacter, με τον παθογόνο μύκητα Cadophora luteo-olivacea, το οποίο τα τελευταία χρόνια σχετίζεται με την ασθένεια του Petri. Με βάση τα παραπάνω, αναπτύχθηκε μία στρατηγική διαχείρισης του παθογόνου P. chlamydospora στο φυτώριο, η οποία βασίστηκε στη χρήση ενός ενδοφυτικού βακτηρίου Bacillus halotolerans ba4, απομονωμένο από τις ρίζες φαινοτυπικά υγιών πρέμνων μεγάλης ηλικίας. Η αξιολόγησή του πραγματοποιήθηκε σε πειράματα in vitro, σε πειράματα θερμοκηπίου και αγρού, ενώ διερευνήθηκε και ο τρόπος δράσης του. Το βακτήριο B. halotolerans ba4, μολονότι παρεμπόδισε την in vitro ανάπτυξη του παθογόνου σε χαμηλό ποσοστό, μείωσε την ασθένεια στα πειράματα θερμοκηπίου κατά περίπου 34% και 57%, σε τεχνητά και σε φυσικά μολυσμένα φυτά, αντίστοιχα. Στα τεχνητά μολυσμένα μοσχεύματα, παρατηρήθηκε μείωση του καστανού μεταχρωματισμού κατά 42%, ενώ τα επίπεδα DNA του παθογόνου βρέθηκαν κατά περίπου 76% και 33%, στις αντίστοιχες επεμβάσεις. Παρομοίως, μετά την εφαρμογή του ba4 στον αγρό, παρατηρήθηκε μείωση του μεταχρωματισμού κατά 26% η οποία συσχετίστηκε με μείωση της βιομάζας του παθογόνου κατά 85%. Επιπλέον, νεαρά πρέμνα στα οποία εφαρμόστηκε ο ba4, παρουσίασαν αυξημένο νωπό βάρος ριζικού συστήματος και υπέργειου μέρους κατά 45% και 43%, αντίστοιχα, ενώ γονίδια σχετιζόμενα με τους αμυντικούς μηχανισμούς, φάνηκε να υπέρ-εκφράζονται στα νεαρά πρέμνα υπό την παρουσία του ba4 και του παθογόνου. Τέλος, η αλληλούχιση και ανάλυση του γονιδιώματος του ba4, έδειξε την παρουσία γονιδιακών συστάδων σχετιζόμενων με την βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών με αντιμικροβιακές ιδιότητες. Επιπλέον, τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν από τη χρήση του βιολογικού παράγοντα T. harzianum T22, επιβεβαίωσαν την βιολογική του δράση μειώνοντας την ασθένεια κατά περίπου 62%, ενώ παράλληλα επέδειξαν την ικανότητά του να αποικίζει τις ρίζες της αμπέλου και να προάγει την ανάπτυξή της. Η αλληλούχιση RNA (RNA-Seq), έδειξε ότι ο Τ22 συμβάλει στην προετοιμασία του φυτού για επικείμενη μόλυνση (priming), αφού παρατηρήθηκε ισχυρή ενεργοποίηση των αμυντικών μηχανισμών παρουσία του παθογόνου. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, εάν αξιοποιηθούν σωστά στην γεωργική πράξη, αποτελούν στρατηγικές που μπορούν να υιοθετηθούν από τα φυτώρια αμπέλου και πιθανά να συμβάλουν στον μετριασμό των μολύνσεων του πολλαπλασιαστικού υλικού από τα παθογόνα ξύλου.