Investigation of the role of microglial cells in the progression of the sporadic form of Alzheimer's disease

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent type of dementia and causes a progres¬sive loss of cognition, for which there is not an effective treatment or cure. Τhere are evidence indicating an important role of neuroinflammation and microglia activation, as well as genetic susceptibility in AD pathogenesis. Recent genome-wide association studies have identified key genetic risk variants, with Bridging Integrator 1 (BIN1), which is highly expressed in microglia, to constitute the second strongest genetic risk factor for late onset AD (LOAD) after apolipoprotein E (APOE). While neuronal BIN1 has been extensively studied and linked to synaptic dysfunction, altered calcium signaling, tau pathology, and neuronal hyperexcitability, the specific role of microglial BIN1 in AD progression remains underexplored, with recent evidence indicating that BIN1 contributes in microglia’s proinflammatory and disease-associated activation states. To this end, we have developed a conditional double transgenic Cx3cr1CreER/+Bin1fl/fl mouse, in which Bin1 is conditionally knocked-out in microglia, and challenged the system with systemic lipopolysaccharide (LPS) administration, to investigate the effect of microglia BIN1 deletion under homeostatic and inflammatory conditions. Single nucleus transcriptome (snRNA Seq) of mouse cortices revealed that, microglial BIN1 deletion is not sufficient to cause significant changes under homeostatic conditions, nevertheless, neuroinflammation elicits upregulation of key genes controlling microglial proliferation (Mki67, Top2a, Knl1, Cenpp) as well as inflammatory response (Stat1, Ifi204, Ifi30, Ptprc). Moreover, gene ontology analysis confirmed enrichment in pathways related to immune responses, endocytosis, type I interferon production, and complement activation. Importantly, LPS induced a substantially stronger transcriptional response in Bin1cKO microglia compared to controls, suggesting that BIN1 deficiency “primes” microglia toward heightened inflammatory activation state. Microglia clustering analysis further identified distinct microglial subpopulations associated with BIN1 deficiency following neuroinflammation. Specifically, clusters enriched in Bin1cKO + LPS animals displayed strong transcriptional signatures of proliferating microglia and interferon-responsive microglia (IRMs), characterized by elevated expression of genes such as Top2a, Mki67, Ifi204, Irf7, Stat1, and Stat2. Furthermore, cell signature analyses demonstrated overlap with previously described disease-associated microglia (DAM) and activated response microglia (ARM) states, that are commonly observed in neurodegenerative disease and aging. These findings indicate that microglial BIN1 deletion promotes a transition toward activated and disease-associated inflammatory phenotypes in response to systemic inflammation. Subsequently, molecular and phenotypic analyses of mouse cortices further supported and confirmed the snRNA-Seq observations. As far as microglial proliferation is concerned, in vivo immunohistochemical analyses revealed significantly increased microglial proliferation in Bin1cKO mice following LPS administration. Concomitantly, morphometric analyses indicated that Bin1cKO even under homeostatic conditions is sufficient to alter microglia phenotype, with BIN1-deficient microglia adopting a hyper-ramified morphology, indicative of an intermediate activation state linked to acute and chronic stress, an effect that was further potentiated upon LPS administration. Additionally, there was an increased CD11c expression in Bin1cKO microglia in response neuroinflammation, further supporting the enhanced activated microglial response. Proteome analysis further supported that microglia Bin1cKO drives distinct inflammatory profiles under both homeostatic and LPS-stimulated conditions in mouse cortical area, with elevated levels of inflammatory cytokines and chemokines and with particularly strong induction following LPS stimulation. Notably, the type I interferon (IFN-I) pathway emerged as a major mediator of the enhanced inflammatory response. Key IFN-I regulators, including Stat1, Irf7, Ifi204, Ifi27l2a, and Oasl2, were significantly upregulated in Bin1cKO cortices following inflammation. Simultaneously, IFI204 protein expression was markedly elevated in microglia, supporting the establishment of an IFN-I-responsive inflammatory phenotype. Importantly, microglial BIN1 deletion also induced non-cell-autonomous effects on other glial populations. Astrocytes and oligodendrocytes displayed transcriptional signatures associated with reactive states, lipid metabolism and myelination. Furthermore, comparison of our sequencing data with human AD snRNA-seq datasets revealed that BIN1 expression is significantly reduced in microglia from individuals with AD during disease progression. Moreover, Bin1cKO and systemic inflammation recapitulate several transcriptomic features observed in early AD pathology, including shared trend of genes implicated in neurodegeneration, interferon signaling and DAM activation. Collectively, our study identifies a feed-forward LPS–BIN1 mechanism in which the loss of microglial BIN1 amplifies a proinflammatory signaling. These findings reveal that BIN1 has a more complex and context-dependent role in neuroinflammation than previously described. Systemic immune challenges disrupt normal microglial activity and may accelerate AD progression. We propose that microglial BIN1 functions as a molecular “gatekeeper,” where its deficiency establishes a "primed" basal state that predisposes the brain to an enhanced inflammatory cascade upon immune challenge that may be either beneficial or detrimental for human BIN1 risk carriers.

Η νόσος Alzheimer αποτελεί τη συχνότερη μορφή άνοιας, προκαλεί προοδευτική απώλεια γνωστικών λειτουργιών, χωρίς να έχει βρεθεί, μέχρι σήμερα, αποτελεσματική θεραπεία. Υπάρχουν ολοένα αυξανόμενα δεδομένα, τα οποία υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της νευροφλεγμονής και ενεργοποίησης της μικρογλοίας, όπως και της γενετικής προδιάθεσης, στην παθογένεια της νόσου. Πρόσφατες μελέτες συσχέτισης σε επίπεδο γονιδιώματος (GWAS) έχουν αναδείξει γονίδια – παράγοντες κινδύνου, με το Bin1, το οποίο εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στη μικρογλοία, να αποτελεί τον δεύτερο ισχυρότερο γενετικό παράγοντα κινδύνου της όψιμης μορφής της νόσου (LOAD), μετά την απολιποπρωτεΐνη Ε (APOE). Ο ρόλος της νευρωνικής BIN1 έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει συσχετιστεί με συναπτική δυσλειτουργία, αλλαγές στη σηματοδότηση ασβεστίου, την παθολογία tau και νευρωνική υπερδιεγερσιμότητα, ώστόσο ο ρόλος της μικρογλιακής BIN1 στην εξέλιξη της νόσου παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητος, με πρόσφατα δεδομένα να υποδεικνύουν ότι η BIN1 συμβάλλει σε στάδια ενεργοποίησης της μικρογλοίας και στην προφλεγμονώδη απόκριση. Έχοντας ως στόχο την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της μικρογλοιακής ΒΙΝ1, αναπτύξαμε ένα διπλά διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού (Cx3cr1CreER/+Bin1fl/fl), στο επιτυγχάνεται η γενετική αποσιώπηση του γονιδίου Bin1 στη μικρογλοία, ύστερα από χρήση ταμοξιφαίνης. Επιπλέον, δημιουργήσαμε φλεγμονή στο ζώο ύστερα από συστημική χορήγηση λιποπολυσακχαρίτη (LPS), προκειμένου να διερευνήσουμε την επίδραση της έλλειψης της μικρογλοιακής BIN1 τόσο σε κατάσταση ομοιόστασης όσο και στη φλεγμονή. Η ανάλυση μεταγραφώματος μοναδιαίων κυττάρων (single nucleus RNA-Sequencing, snRNA-Seq) σε ιστό εγκεφαλικού φλοιού ενήλικων ποντικών αποκάλυψε πως η αποσιώπηση της BIN1 στη μικρογλοία δεν επαρκεί από μόνη της για να προκαλέσει σημαντικές μεταβολές σε επίπεδο μεταφραφώματος υπό ομοιοστατικές συνθήκες. Ωστόσο, η πρόκληση νευροφλεγμονής, οδήγησε σε αυξημένη έκφραση γονιδίων, τα οποία ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό της μικρογλοίας (Mki67, Top2a, Knl1, Cenpp), καθώς και τη φλεγμονώδη απόκρισή της (Stat1, Ifi204, Ifi30, Ptprc). Επιπλέον, η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας επιβεβαίωσε εμπλουτισμό μονοπατιών που σχετίζονται με ανοσολογικές αποκρίσεις, ενδοκυττάρωση, παραγωγή ιντερφερόνης τύπου I και ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος. Σημαντικά, το LPS προκάλεσε ισχυρότερη μεταγραφική απόκριση στη μικρογλοία των Bin1cKO ποντικών σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η έλλειψη του BIN1 «προδιαθέτει» τη μικρογλοία προς μια κατάσταση ενισχυμένης ενεργοποίησης. Υστέρα από ανάλυση συσταδιοποίησης (clustering) των μικρογλοιακών υποπληθυσμών αναδείχθηκαν διακριτοί υποπληθυσμοί οι οποίοι σχετίζονται με την έλλειψη της BIN1 σε συνθήκες νευροφλεγμονής. Πιο συγκεκριμένα, στα Bin1cKO + LPS ζώα εμφανίστηκαν ισχυρές μεταγραφικές υπογραφές πολλαπλασιαζόμενης μικρογλοίας και μικρογλοίας αποκρινόμενης στην ιντερφερόνη (IRMs), με αυξημένη έκφραση γονιδίων όπως τα Top2a, Mki67, Ifi204, Irf7, Stat1 και Stat2. Επιπλέον, αναδείχθηκαν οι υποπληθυσμοί μικρογλοίας σχετιζόμενης με ασθένεια (disease associated microglia-DAM), όσο και της ενεργοποιημένης μικρογλοίας (activated response microglia-ARM), οι οποίoi παρατηρούνται συχνά τόσο σε νευροεκφυλιστικές νόσους όσο και κατά τη γήρανση. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ότι η απώλεια της BIN1 στη μικρογλοία προάγει τη μετάβαση προς ενεργοποιημένους και σχετιζόμενους με τη νόσο φλεγμονώδεις μοριακές υπογραφές, ως απόκριση στη νευροφλεγμονή. Στη συνέχεια, μοριακές και φαινοτυπικές αναλύσεις στον εγκεφαλικό φλοιό επιβεβαίωσαν τα ευρήματα του snRNA-Seq. Όσον αφορά τον πολλαπλασιασμό της μικρογλοίας, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν αύξηση στον πολλαπλασιασμό της μικρογλοίας στα Bin1cKO ποντίκια μετά από χορήγηση LPS. Παράλληλα, μορφομετρικές αναλύσεις έδειξαν ότι η απώλεια του BIN1, ακόμη και υπό ομοιοστατικές συνθήκες, αρκεί για να μεταβάλει τον φαινότυπο της μικρογλοίας, με τα κύτταρα να αποκτούν υπερ-διακλαδισμένη μορφολογία, ενδεικτική μιας ενδιάμεσης κατάστασης ενεργοποίησης που συνδέεται με οξύ και χρόνιο στρες, φαινόμενο, το οποίο ενισχυόταν περαιτέρω ύστερα από χορήγηση LPS. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του δείκτη ενεργοποίησης CD11c στη μικρογλοία των Bin1cKO ποντικών ως απόκριση στη νευροφλεγμονή, ενισχύοντας περαιτέρω την υπόθεση μιας εντονότερης κατάστασης ενεργοποίησης των κυττάρων. Επιπρόσθετα, πρωτεωμική ανάλυση στον εγκεφαλικό φλοιό, υποστήριξε επίσης, ότι η απώλεια της BIN1 στη μικρογλοία οδηγεί σε ένα φλεγμονώδες προφίλ του ιστού τόσο υπό ομοιοστατικές συνθήκες όσο και υπό συνθήκες φλεγμονής, με αισθητά αυξημένα επίπεδα φλεγμονωδών κυτταροκινών και χημειοκινών ύστερα από την πρόκληση νευροφλεγμονής. Αξιοσημείωτα, το μονοπάτι απόκρισης στην ιντερφερόνη τύπου I (IFN-I) αναδείχθηκε ως βασικός διαμεσολαβητής της ενισχυμένης φλεγμονώδους απόκρισης και κύριοι ρυθμιστές της IFN-I, συμπεριλαμβανομένων των Stat1, Irf7, Ifi204, Ifi27l2a και Oasl2, παρουσίασαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα στο φλοιό των Bin1cKO ποντικών μετά από φλεγμονή. Παράλληλα, η έκφραση της πρωτεΐνης IFI204 ήταν σημαντικά αυξημένη στη μικρογλοία, επιβεβαιώνοντας την εγκαθίδρυση ενός φλεγμονώδους φαινοτύπου αποκρινόμενου στην IFN-I. Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζει το γεγονός ότι η απώλεια του BIN1 στη μικρογλοία προκάλεσε επίσης μη κυτταρο-αυτόνομες επιδράσεις σε άλλους γλοιακούς πληθυσμούς. Τα αστροκύτταρα και τα ολιγοδενδροκύτταρα εμφάνισαν μεταγραφικές αλλαγές, οι οποίες σχετίζονται με καταστάσεις ενεργοποίησης, με το μεταβολισμό λιπιδίων και με τη μυελίνωση. Επιπλέον, η σύγκριση των δεδομένων μας με snRNA-seq πακέτα δεδομένων, τα οποία προέρχονται από ασθενείς Alzheimer, αποκάλυψε ότι η έκφραση του BIN1 μειώνεται στα μικρογλοιακά κύτταρα των ασθενών κατά την εξέλιξη της νόσου. Επιπρόσθετα, η απώλεια του Bin1 σε συνδυασμό με συστηματική φλεγμονή στο δικό μας πειραματικό μοντέλο παρουσιάζει κοινά στοιχεία στο μεταγράφωμα με αυτά, τα οποία παρατηρούνται στα πρώιμα στάδια της νόσου, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων, τα οποία εμπλέκονται στη νευροεκφύλιση, τη σηματοδότηση ιντερφερόνης και την ύπαρξη των DAMs. Συνολικά, η μελέτη μας αναδεικνύει έναν μηχανισμό θετικής ανατροφοδότησης μεταξύ LPS και BIN1, σύμφωνα με τον οποίο η απώλεια του BIN1 στη μικρογλοία ενισχύει την προφλεγμονώδη σηματοδότηση. Τα ευρήματα αυτά αποκαλύπτουν ότι η μικρογλοιακή BIN1 διαδραματίζει έναν πιο πολύπλοκο ρόλο στην απόκριση των μικρογλοιακών κυττάρων στη νευροφλεγμονή, από αυτόν που είχε περιγραφεί μέχρι σήμερα, ο οποίος εξαρτάται και από διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και είναι χρονικά και χωρικά ρυθμιζόμενος. Οι ανοσολογικές προκλήσεις διαταράσσουν τη φυσιολογική δραστηριότητα της μικρογλοίας και ενδέχεται να επιταχύνουν την εξέλιξη της νόσου. Τέλος, προτείνεται ότι το μικρογλοιακό BIN1 λειτουργεί ως ένας μοριακός «φύλακας», ενώ η ανεπάρκειά του καθιστά τον εγκέφαλο περισσότερο ευάλωτο στη δημιουργία ενός καταρράκτη συμβάντων ενισχυμένης απόκρισης στη φλεγμονή με πιθανές είτε ευεργετικές είτε επιβλαβείς συνέπειες στους φορείς του παράγοντα κινδύνου.