Ανάπτυξη και βελτιστοποίηση κυτταρικών εργοστασίων με βάση την κυτταρίνη για ενοποιημένη βιοδιεργασία αμύλου προς παραγωγή βιοαιθανόλης

Abstract

White Biotechnology, which focuses on the application of microorganisms and enzymes in industrial bioprocesses with low environmental impact, offers an alternative strategy for developing cell factories (CFs) for the valorization of agricultural by-products and for brewing applications through consolidated bioprocessing (CBP) of starch. The main objective of the thesis was the development of sustainable technology for the production of fermentation products from starchy raw materials, with emphasis on optimizing CFs for bioethanol production via anaerobic fermentation of starch or barley extracts, with or without hops. The term “optimization” refers to a series of experimental procedures that aim to improve the structure and functional parameters of the CFs, with the purpose of enhancing their performance in bioethanol production from starchy extracts. Three CFs were developed using two strategies: (1) preparation of separate compositions BC/Aspergillus awamori and BC/Saccharomyces cerevisiae, and (2) double-layer composition with encapsulation of A. awamori in alginate (A. awamori/ALG) on top of BC or TC with immobilized S. cerevisiae. CF1 consisted of BC/A. awamori and BC/S. cerevisiae, CF2 consisted of A. awamori/ALG–BC/S. cerevisiae, and CF3 consisted of A. awamori/ALG–TC/S. cerevisiae.The main steps of the experimental part included the development of CF1-CF2-CF3 and physicochemical characterization of the individual materials (BC, TC, ALG before and after immobilizations/encapsulations), evaluating morphology, elemental analysis, crystalline structure, porosity, and thermal stability before bioprocessing. Optimization experiments followed maximum ethanol production from pure starch in consolidated bioprocessing (CBP), examining the degree of carrier drying, microorganism concentration, CF concentration in the bioreactor, temperature, starch concentration, and initial pH. Subsequently, a transition was made from commercial starch to real brewing raw materials (barley, hops) with the optimized CFs for bioproduct production. The fermentation products were evaluated for residual glucose, ethanol, pH, total acidity, TPC, antioxidant capacity, and visual characteristics (color, turbidity, homogeneity, sediment, viscosity). A stability study was performed with cold storage at 4°C for 30 days and re-evaluation of the parameters. Finally, the optimized CFs used for CBP were re-examined for morphology, elemental analysis, crystalline structure, porosity, and thermal stability to assess their stability after fermentation stress.SEM and TEM images of CF1 documented the immobilization of cells on BC, with elemental analysis showing more extensive coverage by S. cerevisiae compared to A. awamori. Porosimetry showed drastic reduction in specific surface area, pore volume, and pore size after A. awamori immobilization due to coverage by spore agglomerates, while with S. cerevisiae the reduction was smaller. Crystallinity decreased to 43% for BC/A. awamori and was maintained at 71.5% for BC/S. cerevisiae. Immobilization slightly reduced thermal stability introducing additional decomposition stages without altering the triphasic profile. SEM images of CF2 showed dense coverage of BC/S. cerevisiae with alginate gel that locks the inner layer in a continuous biofilm, with intense Ca presence from CaCl₂ treatment. XRD showed retention of cellulose I structure with partial decrystallization from ALG/A. awamori coating, while thermal analysis confirmed a combined, slightly improved stability compared to the individual materials. SEM images of CF3 confirmed S. cerevisiae immobilization with visualization of intensely swollen structure (ALG-TC) where alginate gel remodels the carrier. Elemental analysis reflects the synergy of biomass and carrier with Ca presence. Porosimetry showed increased specific surface area after alkaline treatment and decrease after immobilization, with the mean pore size remaining stable. XRD confirmed retention of Iβxxiipolymorph, while thermal analysis showed DTG maximum shift toward higher temperatures and increased ash (17.6%) compared to individual materials (7.0–13.4%). The CF after optimization for maximum ethanol yield on pure commercial starch solution substrate in a single fermentation stage for consolidated bioprocess of starch (CBP) at 5% w/v starch, which were used for further study on real brewing raw materials (barley and hops), under optimal fermentation conditions (temperature: 30°C and initial pH of amylaceous substrate: 5.5), showed the following results: 1. In optimized CF1, on the 7th fermentation day, a maximum ethanol yield of 0.511 (g/g starch) was recorded (90% of theoretical yield), while the most efficient CF ratio (g)/mL of amylaceous substrate was 1 g/100mL. 2. In optimized CF2, on the 7th fermentation day, a maximum ethanol yield of 0.513 (g/g starch) was recorded (91% of theoretical yield), while the most efficient CF ratio (g)/mL of amylaceous substrate was 1.5 g/100mL. 3. In optimized CF3, on the 7th fermentation day, a maximum ethanol yield of 0.508 (g/g starch) was recorded (90% of theoretical yield), while the most efficient CF ratio (g)/mL of amylaceous substrate was 3 g/100mL. Stability studies over 3 consecutive cycles for all the above cell factories showed a reduction in yield from the 1st to the 2nd consecutive fermentation cycle of 11-13% and from the 2nd to the 3rd consecutive fermentation cycle of 18-19%. Regarding the results for the selected optimized CF used on barley extract substrate in a single fermentation stage for consolidated bioprocess of barley (CBP) at 10% w/v barley, fermentation conditions (temperature: 30°C and initial pH of barley extract: 6.1): 1. For optimized CF1, on the fourth (4th) fermentation day, maximum ethanol of 3.45 (%, v/v), final pH 3.34, total acidity 9.0 (mEq/L), total phenolic content 235.58 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 28.75 (%) were recorded. 2. For optimized CF2, on the fourth (4th) fermentation day, maximum ethanol of 3.62 (%, v/v), final pH 4.25, total acidity 7.0 (mEq/L), total phenolic content 268.57 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 30.61 (%) were recorded. 3. For optimized CF3, on the fourth (4th) fermentation day, maximum ethanol of 3.89 (%, v/v), final pH 3.40, total acidity 10.0 (mEq/L), total phenolic content 210.62 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 23.63 (%) were recorded. From the stability study with cold storage (4°C for 30 days) of the above fermentation products from barley extract substrate using optimized CF, the results recorded were as follows: 1. For optimized CF1, maximum ethanol of 3.46 (%, v/v), final pH 3.24, total acidity 9.0 (mEq/L), total phenolic content 211.46 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 24.11 (%) were recorded. 2. For optimized CF2, maximum ethanol of 3.65 (%, v/v), final pH 4.17, total acidity 6.0 (mEq/L), total phenolic content 262.95 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 27.25 (%) were recorded. 3. For optimized CF3, maximum ethanol of 3.89 (%, v/v), final pH 3.40, total acidity 9.0 (mEq/L), total phenolic content 166.23 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 13.17 (%) were recorded.xxiiiFrom the stability study of optimized CF over 5 consecutive fermentation cycles of 10% w/v barley (consolidated bioprocess of barley, CBP) and fermentation conditions (temperature: 30°C and initial pH of barley extract: 6.1), the results in the 5th consecutive fermentation cycle with the same optimized CF showed: 1. For optimized CF1, a reduction in maximum ethanol of 28% was recorded, while the remaining parameters remained at satisfactory levels recording total acidity 7.0 (mEq/L), total phenolic content 217.63 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 17.64 (%). 2. For optimized CF2, a reduction in maximum ethanol of 39% was recorded, while the remaining parameters remained at satisfactory levels recording total acidity 6.0 (mEq/L), total phenolic content 211.56 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 17.01 (%). 3. For optimized CF3, a reduction in maximum ethanol of 47% was recorded, while the remaining parameters remained at satisfactory levels recording total acidity 7.0 (mEq/L), total phenolic content 166.69 (mg GAE/L), and antioxidant capacity 20.06 (%). Further stability studies during cold storage of fermentation products from consecutive cycles in barley extract showed similar qualitative characteristics. The effect of hopping was studied through three barley extracts (Types V–VII) with the addition of hops (0.5 g/L) at different stages of extraction. The extracts showed similar pH (5.40–5.90) and total acidity (2 mEq/L), with the main differences observed in TPC and antioxidant capacity, where Type V extract (addition of hops at the beginning for 60 minutes) showed the highest values (329.31 mg GAE/L and 51.22%), indicating that the extended co-extraction time favors the extraction of phenolics. The fermented products from Type V extract recorded ethanol 3.53–3.64% v/v, from Type VI extract (addition of hops before the end for 15 minutes) 3.31–3.44% v/v, and from Type VII extract 3.15–3.25% v/v. Compared to the reference product (Type IV extract, 10% w/v barley), the products with hops showed comparable ethanol but significantly enhanced antioxidant profile, reaching maximum TPC of 379.37 mg GAE/L and antioxidant capacity of 59.42% using CF2 in Type V extract. The stability check of the CFs after fermentation stress showed that their use in starch extract fermentations did not drastically alter the cellulose structure, with SEM images confirming retention of the classical structure. Elemental analysis showed enrichment in nitrogen (6.20–12.59% w/w) and decrease in C/N ratio due to accumulation of cellular biomass and nitrogenous metabolites.

Η Λευκή Βιοτεχνολογία, που εστιάζει στην εφαρμογή μικροοργανισμών και ενζύμων σε βιομηχανικές βιοδιεργασίες χαμηλού περιβαλλοντικού φορτίου, προσφέρει εναλλακτική στρατηγική ανάπτυξης κυτταρικών εργοστασίων (KE) για αξιοποίηση των γεωργικών παραπροϊόντων και εφαρμογές στη ζυθοποιία μέσω ενοποιημένης βιοεργασίας (CBP) του αμύλου. Κεντρικός στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη βιώσιμης τεχνολογίας για παραγωγή προϊόντων ζύμωσης από αμυλούχες πρώτες ύλες, με έμφαση στη βελτιστοποίηση KE για παραγωγή βιοαιθανόλης μέσω αναερόβιων ζυμώσεων αμύλου ή εκχυλισμάτων κριθαριού, με ή χωρίς λυκίσκο. Ο όρος «βελτιστοποίηση» αναφέρεται σε μια σειρά πειραματικών διαδικασιών που στοχεύουν στη βελτίωση της δομής και των λειτουργικών παραμέτρων των KE, με σκοπό την ενίσχυση της απόδοσής τους στην παραγωγή βιοαιθανόλης από αμυλούχα εκχυλίσματα. Αναπτύχθηκαν τρία ΚΕ με δύο στρατηγικές: (1) παρασκευή ξεχωριστών συνθέσεων ΒΚ/Aspergillus awamori και ΒΚ/Saccharomyces cerevisiae, και (2) σύνθεση διπλής στιβάδας με ενθυλάκωση A. awamori σε αλγινικό (A. awamori/ΑΛΓ) πάνω σε ΒΚ ή ΣΚ με ακινητοποιημένο S. cerevisiae. Το ΚΕ1 αποτελούταν από ΒΚ/A. awamori και ΒΚ/S. cerevisiae, το ΚΕ2 από A. awamori/ΑΛΓ–ΒΚ/S. cerevisiae και το ΚΕ3 από A. awamori/ΑΛΓ–ΣΚ/S. cerevisiae.Τα βασικά βήματα υλοποίησης του πειραματικού μέρους περιλάμβαναν την ανάπτυξη των ΚΕ1-ΚΕ2-ΚΕ3 και φυσικοχημικό χαρακτηρισμό των επιμέρους υλικών (ΒΚ, ΣΚ, ΑΛΓ πριν και μετά τις ακινητοποιήσεις/ενθυλακώσεις), αξιολογώντας μορφολογία, στοιχειακή ανάλυση, κρυσταλλική δομή, πορώδες και θερμική σταθερότητα πριν τη βιοδιεργασία. Ακολούθησαν πειράματα βελτιστοποίησης για μέγιστη παραγωγή αιθανόλης από καθαρό άμυλο σε ενοποιημένη διεργασία (CBP), εξετάζοντας βαθμό ξήρανσης του φορέα, συγκέντρωση μικροοργανισμού, συγκέντρωση ΚΕ στον βιοαντιδραστήρα, θερμοκρασία, συγκέντρωση αμύλου και αρχικό pH. Στη συνέχεια έγινε μετάβαση από άμυλο εμπορίου σε πραγματικές πρώτες ύλες ζυθοποιίας (κριθάρι, λυκίσκος) με τα βελτιστοποιημένα ΚΕ για παραγωγή βιοπροϊόντων. Τα προϊόντα ζύμωσης αξιολογήθηκαν ως προς υπολειμματική γλυκόζη, αιθανόλη, pH, ολική οξύτητα, ΟΦΠ, αντιοξειδωτική ικανότητα και οπτικά χαρακτηριστικά (χρώμα, θολερότητα, ομοιογένεια, ίζημα, ιξώδες). Πραγματοποιήθηκε μελέτη σταθερότητας με ψυχρή αποθήκευση στους 4°C για 30 ημέρες και επαναξιολόγηση των παραμέτρων. Τέλος, τα βελτιστοποιημένα ΚΕ που χρησιμοποιήθηκαν για CBP εξετάστηκαν εκ νέου ως προς μορφολογία, στοιχειακή ανάλυση, κρυσταλλική δομή, πορώδες και θερμική σταθερότητα για αξιολόγηση της σταθερότητάς τους μετά τη ζυμωτική καταπόνηση. Οι απεικονίσεις SEM και TEM του ΚΕ1 τεκμηρίωσαν την ακινητοποίηση των κυττάρων στη ΒΚ, με τη στοιχειακή ανάλυση να δείχνει εκτενέστερη επικάλυψη από S. cerevisiae συγκριτικά με A. awamori. Η ποροσιμετρία έδειξε δραστική μείωση ειδικής επιφάνειας, όγκου και μεγέθους πόρων μετά την ακινητοποίηση του A. awamori λόγω επικάλυψης από συσσωματώματα σπορίων, ενώ με S. cerevisiae η μείωση ήταν μικρότερη. Η κρυσταλλικότητα μειώθηκε στο 43% για BK/A. awamori και διατηρήθηκε στο 71,5% για BK/S. cerevisiae. Η ακινητοποίηση μείωσε ελαφρά τη θερμική σταθερότητα εισάγοντας επιπλέον στάδια αποδόμησης χωρίς να αλλοιώσει το τριφασικό προφίλ. Οι SEM απεικονίσεις του ΚΕ2 έδειξαν πυκνή κάλυψη της ΒΚ/S. cerevisiae με αλγινική πηκτή που κλειδώνει την εσωτερική στιβάδα σε συνεχές βιοφιλμ, με έντονη παρουσία Ca από την κατεργασία με CaCl₂. Η XRD έδειξε διατήρηση της δομής κυτταρίνης Ι με μερική αποκρυστάλλωση από την επικάλυψη ΑΛΓ/A. awamori, ενώ η θερμική ανάλυση επιβεβαίωσε συνδυασμένη, ελαφρώς βελτιωμένη σταθερότητα σχέση με τα επιμέρους υλικά. Οι SEM απεικονίσεις του ΚΕ3 επιβεβαίωσαν την ακινητοποίηση του S. cerevisiae με απεικόνιση έντονης διογκωμένη δομής (ΑΛΓ-ΣΚ) όπου η αλγινική πηκτή αναδιαμορφώνει τον φορέα. Η στοιχειακή ανάλυση αντικατοπτρίζει τη συνέργεια βιομάζας και φορέα με παρουσία Ca. Η ποροσιμετρία έδειξε αύξηση ειδικής επιφάνειας μετά την αλκαλική επεξεργασία και μείωση μετά την ακινητοποίηση, με το μέσο μέγεθος πόρου να παραμένει σταθερό. Η XRD επιβεβαίωσε διατήρηση του πολυμορφισμού Iβ, ενώ η θερμική ανάλυση έδειξε μετατόπιση του DTG μέγιστου προς υψηλότερες θερμοκρασίες και αυξημένη τέφρα (17,6%) σε σχέση με τα επιμέρους υλικά (7,0–13,4%). Τα ΚΕ μετά τη βελτιστοποίηση ως προς τη μέγιστη απόδοση αιθανόλης σε υπόστρωμα καθαρού διαλύματος αμύλου εμπορίου σε ένα στάδιο ζύμωσης για ενοποιημένη βιοδιεργασία 5% w/v αμύλου (Consolidated bioprocess of starch, CBP), τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω μελέτη σε πραγματικές πρώτες ύλες ζυθοποιίας (κριθάρι και λυκίσκος), στις βέλτιστες συνθήκες ζύμωσης (θερμοκρασία: 30oC και αρχική τιμή pH αμυλούχου υποστρώματος: 5,5), έδειξαν τα εξής αποτελέσματα: 1. Στο βέλτιστο ΚΕ1 καταγράφηκε την έβδομη (7η) ημέρα ζύμωσης μέγιστη απόδοση σε αιθανόλη 0,511 (g/g αμύλου) (90% της θεωρητικής απόδοσης), ενώ η αποδοτικότερη αναλογία ΚΕ (g) /mL αμυλούχου υποστρώματος ήταν το 1 g/100mL. 2. Στο βέλτιστο ΚΕ2 καταγράφηκε την έβδομη (7η) ημέρα ζύμωσης μέγιστη απόδοση σε αιθανόλη 0,513 (g/g αμύλου) (91% της θεωρητικής απόδοσης), ενώ η αποδοτικότερη αναλογία ΚΕ (g) /mL αμυλούχου υποστρώματος ήταν το 1,5 g/100mL. 3. Στο βέλτιστο ΚΕ3 καταγράφηκε την έβδομη (7η) ημέρα ζύμωσης μέγιστη απόδοση σε αιθανόλη 0,508 (g/g αμύλου) (90% της θεωρητικής απόδοσης), ενώ η αποδοτικότερη αναλογία ΚΕ (g) /mL αμυλούχου υποστρώματος ήταν τα 3g/100mL. Η μελέτη σταθερότητας σε 3 διαδοχικούς κύκλους για τα όλα τα παραπάνω κυτταρικά εργοστάσια έδειξαν μείωση της απόδοσης από τον 1ο στον 2ο διαδοχικό κύκλο ζύμωσης κατά 11-13% και από τον 2ο στον 3ο διαδοχικό κύκλο ζύμωσης κατά 18-19%. Όσον αφορά τα αποτελέσματα, για τα επιλεγμένα βελτιστοποιημένα ΚΕ που χρησιμοποιήθηκαν σε υπόστρωμα εκχυλίσματος κριθαριού σε ένα στάδιο ζύμωσης για ενοποιημένη διεργασία 10% w/v κριθαριού (Consolidated bioprocess of barley, CBP), συνθήκες ζύμωσης (θερμοκρασία: 30oC και αρχική τιμή pH εκχυλίσματος κριθαριού: 6,1): 1. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ1, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,45 (%, v/v), τελικό pH 3,34, ολική οξύτητα 9,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 235,58 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 28,75 (%). 2. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ2, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,62 (%, v/v), τελικό pH 4,25, ολική οξύτητα 7,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 268,57 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 30,61 (%). 3. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ3, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,89 (%, v/v), τελικό pH 3,40, ολική οξύτητα 10,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 210,62 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 23,63 (%). Από τη μελέτη σταθερότητας με ψυχρή αποθήκευση (4oC για 30 ημέρες) των παραπάνω προϊόντων ζύμωσης από υπόστρωμα εκχυλίσματος κριθαριού με χρήση των βελτιστοποιημένων ΚΕ, τα αποτελέσματα που καταγράφηκαν ήταν τα εξής: 1. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ1, καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,46 (%, v/v), τελικό pH 3,24, ολική οξύτητα 9,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 211,46 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 24,11 (%). 2. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ2, καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,65 (%, v/v), τελικό pH 4,17, ολική οξύτητα 6,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 262,95 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 27,25 (%). 3. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ3, καταγράφηκαν μέγιστη αιθανόλη 3,89 (%, v/v), τελικό pH 3,40, ολική οξύτητα 9,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 166,23 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 13,17 (%). Από τη μελέτη σταθερότητας των βελτιστοποιημένων ΚΕ σε 5 διαδοχικούς κύκλους ζύμωσης 10% w/v κριθαριού (Consolidated bioprocess of barley, CBP) και συνθήκες ζύμωσης (θερμοκρασία: 30oC και αρχική τιμή pH εκχυλίσματος κριθαριού: 6,1), τα αποτελέσματα, στον 5ο κύκλο διαδοχικής ζύμωσης με το ίδιο βελτιστοποιημένο ΚΕ, έδειξαν: 1. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ1, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκε μείωση μέγιστης αιθανόλης κατά 28%, ενώ οι υπόλοιπες παράμετροι παρέμειναν σε ικανοποιητικό επίπεδο καταγράφοντας ολική οξύτητα 7,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 217,63 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 17,64 (%). 2. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ2, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκε μείωση μέγιστης αιθανόλης κατά 39%, ενώ οι υπόλοιπες παράμετροι παρέμειναν σε ικανοποιητικό επίπεδο καταγράφοντας ολική οξύτητα 6,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 211,56 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 17,01 (%). 3. Για το βελτιστοποιημένο ΚΕ3, την τέταρτη (4η) ημέρα ζύμωσης καταγράφηκε μείωση μέγιστης αιθανόλης κατά 47%, ενώ οι υπόλοιπες παράμετροι παρέμειναν σε ικανοποιητικό επίπεδο καταγράφοντας ολική οξύτητα 7,0 (mEq/L), ολικό φαινολικό περιεχόμενο 166,69 (mg GAE/L) και αντιοξειδωτική ικανότητα 20,06 (%). Η περαιτέρω μελέτη σταθερότητας κατά τη ψυχρή αποθήκευση των προϊόντων ζύμωσης των διαδοχικών κύκλων σε εκχύλισμα κριθαριού έδειξαν παρόμοια ποιοτικά χαρακτηριστικά. Η επίδραση της προσθήκης του λυκίσκου μελετήθηκε μέσω τριών εκχυλισμάτων κριθαριού (Τύπου V–VII) με προσθήκη του (0,5 g/L) σε διαφορετικά στάδια της εκχύλισης. Τα εκχυλίσματα παρουσίασαν παρόμοιο pH (5,40–5,90) και ολική οξύτητα (2 mEq/L), με κύριες διαφοροποιήσεις στο ολικό φαινολικό περιεχόμενο (ΟΦΠ) και την αντιοξειδωτική ικανότητα, όπου το εκχύλισμα Τύπου V (προσθήκη λυκίσκου στην αρχή για 60 λεπτά) εμφάνισε τις υψηλότερες τιμές (329,31 mg GAE/L και 51,22%), επιβεβαιώνοντας ότι ο παρατεταμένος χρόνος συνεκχύλισης ευνοεί την εκχύλιση φαινολικών. Τα ζυμωμένα προϊόντα από εκχύλισμα Τύπου V κατέγραψαν αιθανόλη 3,53–3,64% v/v, από εκχύλισμα Τύπου VI (προσθήκη λυκίσκου πριν το τέλος για 15 λεπτά) 3,31–3,44% v/v, και από εκχύλισμα Τύπου VII 3,15–3,25% v/v. Σε σχέση με το προϊόν αναφοράς (εκχύλισμα Τύπου IV, 10% w/v κριθάρι), τα προϊόντα με λυκίσκο παρουσίασαν συγκρίσιμη αιθανόλη αλλά σαφώς αναβαθμισμένο αντιοξειδωτικό προφίλ, φθάνοντας μέγιστο ΟΦΠ τα 379,37 mg GAE/L και αντιοξειδωτική ικανότητα 59,42% με χρήση του ΚΕ2 στο εκχύλισμα Τύπου V. Ο έλεγχος σταθερότητας των ΚΕ μετά τη ζυμωτική καταπόνηση έδειξε ότι η χρήση τους σε ζυμώσεις αμυλούχων εκχυλισμάτων δεν αλλοίωσε δραστικά τη δομή της κυτταρίνης, με τις απεικονίσεις SEM να επιβεβαιώνουν διατήρηση της κλασικής δομής. Η στοιχειακή ανάλυση έδειξε εμπλουτισμό σε άζωτο (6,20–12,59% w/w) και μείωση της C/N λόγω συσσώρευσης κυτταρικής βιομάζας και αζωτούχων μεταβολιτών.