Investigation of the immune dysregulation in bronchiectasis and identification of novel biomarkers of disease activity and severity and patient-reported outcomes

Abstract

Background: Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are a heterogeneous population of immature myeloid cells, which suppress innate and adaptive immune responses in chronic diseases, while regulatory T cells (Tregs) are key immunomodulators maintaining immune tolerance. Plasma fibrinogen and fractional exhaled nitric oxide (FeNO) reflect neutrophilic and eosinophilic airway inflammation, respectively, and are associated with disease activity and severity in different directions in bronchiectasis. Aims: We aimed to characterise the circulating and airway reservoir, functionality, interrelations with effector lymphocytes, and transcriptional profiles of MDSCs and Tregs in bronchiectasis, as well as to concurrently investigate fibrinogen and FeNO and further evaluate the clinical importance of fibrinogen-to-FeNO ratio (FFR) as a composite biomarker in the disease. Materials and Methods: A total of 52 clinically stable patients with cystic fibrosis (CF, six individuals) or non-CF bronchiectasis (46 individuals) and 48 healthy controls were enrolled. Circulating and bronchoalveolar MDSCs, Tregs, and effector lymphocyte subsets (B, helper and cytotoxic T, and natural killer cells) were quantified by flow cytometry. Functional assays were used to assess the T-cell suppression and Treg induction capacity of MDSCs in peripheral blood mononuclear cells. Transcriptome analysis of circulating MDSCs and T cells was conducted. Fibrinogen, FeNO, and the ratio of their normalised values (FFR) were investigated in relation to clinical indicators of disease activity and severity, including respiratory symptoms, inflammatory markers, pulmonary function, radiological extent, airway infection, severity scores, and patient-reported outcomes. Results: Circulating total, polymorphonuclear, and monocytic MDSCs were found expanded (p < 0.001, < 0.0001, and < 0.01, respectively) and functionally enhanced, while circulating Tregs and B cells were found contracted (p < 0.001 and < 0.05, respectively) in patients compared to controls. Pulmonary accumulation of MDSCs and their subpopulations (p < 0.01), but not Tregs, was also observed in patients. The enriched ontology clusters of multiple differentially expressed genes in patients’ MDSCs and T cells reflected altered MDSC-mediated immune response and impaired T-cell proliferation with patterns that resemble respiratory infections and autoimmune diseases. FFR was correlated with both circulating neutrophils (r = 0.36, p < 0.05) and eosinophils (r = −0.39, p < 0.05) and, more strongly compared to fibrinogen and FeNO, with the percentage of predicted forced expiratory volume in the 1st second (r = −0.61, p < 0.001). Interestingly, only FFR was found higher in patients with Pseudomonas aeruginosa isolation in respiratory secretions (p < 0.01). In receiver operating characteristic curves, FFR showed good discriminatory ability to differentiate patients with any level (AUC: 0.80, 95% CI: 0.64–0.96) or severe level (AUC: 0.83, 95% CI: 0.64–1.00) of pulmonary functional impairment and patients with severe disease (AUC: 0.78, 95% CI: 0.62–0.94). Conclusions: Expansion of MDSCs and impaired induction of Tregs characterise bronchiectasis leading to innate–adaptive immune dysregulation, impairing effector responses and immune tolerance. FFR emerges as a candidate biomarker capturing the balance between neutrophilic and eosinophilic inflammation and the net disease activity and severity in bronchiectasis.

Εισαγωγή: Τα μυελικά κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) είναι ένας ετερογενής πληθυσμός ανώριμων μυελικών κυττάρων, τα οποία καταστέλλουν τις έμφυτες και τις επίκτητες ανοσολογικές αποκρίσεις σε χρόνιες νόσους, ενώ τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) είναι βασικοί ανοσοτροποποιητές που διατηρούν την ανοσολογική ανοχή. Το ινωδογόνο πλάσματος και το κλασματικό εκπνεόμενο μονοξείδιο του αζώτου (FeNO) αντανακλούν την ουδετεροφιλική και ηωσινοφιλική φλεγμονή των αεραγωγών, αντίστοιχα, και σχετίζονται με την ενεργότητα και τη σοβαρότητα της νόσου σε αντίθετες κατευθύνσεις στις βρογχεκτασίες. Στόχοι: Στόχοι μας ήταν να χαρακτηρίσουμε το πλήθος στη συστηματική κυκλοφορία και τον κατώτερο αεραγωγό, τη λειτουργικότητα, τις αλληλεπιδράσεις με τα δραστικά λεμφοκύτταρα και τα μεταγραφικά προφίλ των MDSCs και των Tregs στις βρογχεκτασίες, όπως επίσης να διερευνήσουμε ταυτόχρονα το ινωδογόνο και το FeNO και να αξιολογήσουμε περαιτέρω την κλινική σημασία του λόγου ινωδογόνου προς FeNO (FFR) ως έναν σύνθετο βιολογικό δείκτη στη νόσο. Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά συμμετείχαν 52 κλινικά σταθεροί ασθενείς με κυστική ίνωση (CF, έξι άτομα) ή βρογχεκτασίες χωρίς CF (46 άτομα) και 48 υγιείς μάρτυρες. Τα κυκλοφορούντα και βρογχοκυψελιδικά MDSCs, τα Tregs και οι υποπληθυσμοί των δραστικών λεμφοκυττάρων (Β, βοηθητικά και κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και φυσικά φονικά κύτταρα) ποσοτικοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Χρησιμοποιήθηκαν λειτουργικές δοκιμασίες για την αξιολόγηση της καταστολής των Τ κυττάρων και της ικανότητας επαγωγής των Tregs από τα MDSCs σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος. Διεξήχθη ανάλυση μεταγραφώματος των κυκλοφορούντων MDSCs και Τ κυττάρων. Το ινωδογόνο, το FeNO και ο λόγος των κανονικοποιημένων τιμών τους (FFR) διερευνήθηκαν σε σχέση με κλινικούς δείκτες ενεργότητας και σοβαρότητας της νόσου, συμπεριλαμβανομένων των αναπνευστικών συμπτωμάτων, των φλεγμονωδών δεικτών, της πνευμονικής λειτουργίας, της ακτινολογικής έκτασης, της λοίμωξης των αεραγωγών, των κλιμάκων σοβαρότητας και των αναφερόμενων από τους ασθενείς εκβάσεων. Αποτελέσματα: Τα κυκλοφορούντα συνολικά, πολυμορφοπυρηνικά και μονοκυτταρικά MDSCs ανευρέθηκαν ποσοτικά αυξημένα (p < 0.001, < 0.0001 και < 0.01, αντίστοιχα) και λειτουργικά ενισχυμένα, ενώ τα κυκλοφορούντα Tregs και Β κύτταρα ανευρέθηκαν ποσοτικά μειωμένα (p < 0.001 και < 0.05, αντίστοιχα) στους ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Πνευμονική συσσώρευση των MDSCs και των υποπληθυσμών τους (p < 0.01), αλλά όχι των Tregs, παρατηρήθηκε, επίσης, στους ασθενείς. Οι εμπλουτισμένες οντολογικές συστάδες πολλαπλών διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στα MDSCs και τα Τ κύτταρα των ασθενών ανέδειξαν αλλοιωμένη ανοσολογική απόκριση μέσω των MDSCs και μειωμένο πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων, με πρότυπα που προσομοιάζουν με αναπνευστικές λοιμώξεις και αυτοάνοσες νόσους. Ο FFR συσχετίστηκε τόσο με τα κυκλοφορούντα ουδετερόφιλα (r = 0.36, p < 0.05) όσο και με τα ηωσινόφιλα (r = −0.39, p < 0.05) και, πιο έντονα σε σύγκριση με το ινωδογόνο και το FeNO, με το ποσοστό του προβλεπόμενου βιαίως εκπνευστικού όγκου στο 1ο δευτερόλεπτο (r = −0.61, p < 0.001). Είναι αξιοσημείωτο ότι μόνο ο FFR ανευρέθηκε υψηλότερος σε ασθενείς με απομόνωση Pseudomonas aeruginosa σε αναπνευστικές εκκρίσεις (p < 0.01). Στις χαρακτηριστικές καμπύλες λειτουργίας του δέκτη, ο FFR έδειξε καλή διακριτική ικανότητα να διαφοροποιεί ασθενείς με οποιοδήποτε επίπεδο (AUC: 0.80, 95% CI: 0.64–0.96) ή σοβαρό επίπεδο (AUC: 0.83, 95% CI: 0.64–1.00) πνευμονικής λειτουργικής διαταραχής και ασθενείς με σοβαρή νόσο (AUC: 0.78, 95% CI: 0.62–0.94). Συμπεράσματα: Η αύξηση των MDSCs και η μειωμένη επαγωγή των Tregs χαρακτηρίζουν τις βρογχεκτασίες, οδηγώντας στη δυσρύθμιση της έμφυτης και επίκτητης ανοσίας και επηρεάζοντας τις δραστικές αποκρίσεις και την ανοσολογική ανοχή. Ο FFR αναδεικνύεται ως υποψήφιος βιολογικός δείκτης που εκφράζει την ισορροπία μεταξύ ουδετεροφιλικής και ηωσινοφιλικής φλεγμονής και τη συνισταμένη ενεργότητα και σοβαρότητα της νόσου στις βρογχεκτασίες.