Μελέτη της δομής της χρωματίνης και των ρυθμιστικών περιοχών του γονιδιώματος στην εγκαθίδρυση των προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα θηλαστικών μέσω γονιδιωματικής τεχνολογίας και βιοπληροφορικής ανάλυσης

Abstract

Viral Infections inflict a lasting negative impact on human health and in many cases act as causal factors for the development of waves of worldwide morbidity and mortality among human populations, which lead to the generation, spreading and establishment of pandemics. Viral Infections are classified among the most common infectious phenomena and are responsible for severe pathogenic phenotypes that characterize well-known infectious human diseases such as Ebola (Ersching and Victora, 2019), Asthma (Virgin 2014), AIDS, Hepatitis B and C (Yuen et al., 2018), Influenza (Iwasaki and Pillai, 2014), Type 1 Diabetes (T1D) (Foxman and Iwasaki, 2011) and Herpes (Canny et al., 2014). The recent dramatic example of Severe Acute Respiratory Virus 2 (SARS- CoV-2) spreading among human populations and the subsequent establishment of COVID-19 disease (Andreakos and Tsiodras, 2020, Xie et al., 2020) characterized by variable phenotypes ranging from fever and breathing difficulty to acute respiratory distress and death (Huang et al., 2020, Zhu et al., 2020), exemplifies the above- mentioned capacity of Viruses to cause deleterious effects to human homeostasis, health, and longevity. The accelerated pattern of expansion of Viral Infections outbreaks across modern societies inflicts a heavy impact on the global health system with far-reaching social and financial ramifications. Viruses invade humans through multiple portals of entry (e.g. epithelial and mucosal surfaces, the respiratory system, the alimentary tract) (Foxman and Iwasaki, 2011, Fenner 1996), followed by an antagonistic interplay between Viral-invasion and antiviral host defense mechanisms. The inability of the human organism to combat this harmful environmental stimulus, via the accurate activation of its antiviral immune response mechanisms (Foxman and Iwasaki, 2011), is frequently followed by widespread distribution of Viral load across human body segments. There are multiple layers of regulation and a plethora of implicated factors, capable of influencing the described molecular events, thus contributing to the evolvement of disease-risk variation between individuals. For instance, the immunophenotype of the host, the interaction between Viruses and other microbes and the exact genetic predisposition have been proposed (Virgin 2014) as crucial parameters, which dictate the susceptibility or resistance of individuals to specific Viral Infections and contribute to the variability of the pathogenic phenotypes emerged. At the cellular level Viral Infections lead to transcriptional reprogramming of human cells by triggering diverse sets of signal transduction pathways and sequence-specific transcription factors (Agelopoulos and Thanos, 2006, Lavigne et al., 2015, Canny et al., 2014, Thanos and Maniatis 1995), orchestrating the expression of their target genes. This combinatorial molecular transmission of the environmental stimuli inside the nucleus promotes the differential expression of numerous of human genes and subsequently the establishment of the human antiviral gene expression programs. The human genome was shaped by the evolution to create Homo sapiens (Rickels and Shilatifard, 2018) and is classified in two major segments termed coding (~2%; composed of nearly ~20.000 of genes) and non-coding or regulatory (98%; composed by a multitude of domains a part of which instructs gene expression) (Agelopoulos and Thanos 2006, Shlyueva et al., 2014). In human cells, the approximately 20.000 protein-coding genes are controlled by ~106 DNA regulatory elements (The ENCODE project consortium 2012), organized in Cis Regulatory Modules (CRMs) such as enhancers, which are interspersed across the genome and operate as rheostats of gene expression (Agelopoulos et al., 2012, Agelopoulos et al., 2014). The crucial role of enhancers for human physiology is underlined by the effects of their structural, sequence, and biochemical alternations, on cellular homeostasis, as described in the recently developed scientific field of enhanceropathies (Smith and Shilatifard, 2014, Rickels and Shilatifard, 2018), a term used to characterize severe human pathogenic phenotypes that arise as an outcome of aberrant gene expression programs imposed by sequence and structural alterations in the non-coding segments of the human genome. The recent finding that the majority of genetic polymorphisms associated with diseases are mapped to the non-coding parts of the genome (Hindorff et al., 2009) underscores more emphatically the above considerations. In this regard, there is an urgent need for an in-depth examination of both the coding and regulatory segments of the human genome engaged to antiviral response of human cells in order to understand the molecular basis of the Viral-imposed human diseases. Fundamental progress has been achieved in the field of molecular epidemiology of Viruses (Foxman and Iwasaki, 2011) as well as in the analysis of the molecular basis of transcriptional reprogramming occurring in Virus-infected human cells (Agelopoulos and Thanos, 2006, Lavigne et al., 2015, Canny et al., 2014), a large part of the molecular choreography of the antiviral response instructed in human cells remains elusive. Thus, there is an urgent need for an in-depth examination of the molecular mechanisms, encrypted inside the human genome, which operate during Viral Infections in order to understand the molecular basis of Viral-imposed human diseases. Accordingly, a series of fundamental questions outlined below should be addressed:•Which is the total repertoire of antiviral genes and how the kinetics of their expression are followed? Is it possible different groups of antiviral genes to follow distinct molecular mechanisms for their regulation?•How chromatin structure and architecture is shaped across the regulatory regions of the genome such as enhancers and super-enhancers (SEs) during the antiviral response of mammalian cells?•Which are the principles and particles of the molecular mechanism that mammalian cells employ in order to decode the signal of Viral infection into the nucleus and subsequently to establish an antiviral gene expression program? Do regulatory elements of the genome such as enhancers and super-enhancers (SEs) coordinate the establishment of antiviral gene expression programs? As it is well-respected, enhancers are enriched for transcription factors and histone modifications during antiviral response.The aforementioned aims constitute the goal of this research for PhD Thesis, which is to decipher the role of both chromatin structure and functional regulatory elements such as enhancers and Super-enhancers (SEs) of the mammalian genome during the establishment of the gene expression programs that accompany antiviral cellular response in diverse tissues. The research for the doctoral thesis will be applied in experimental systems-models that include mammalian cell lines (human and mouse) and employ advanced experimental rationale/strategy ideal to lead to a holistic investigation of the genome and transcriptome in combination with precise experimental methods of cellular and molecular biology, biochemistry, genomics, integrative bioinformatics analysis and computational biology pipelines. The completion of the research for PhD Thesis will lead to the construction of the genomics Hyper-Atlas of antiviral cellular response of mammals.

Οι Ιϊκές μολύνσεις προκαλούν υψηλά επίπεδα νοσηρότητας και θνησιμότητας, αποτελώντας παγκόσμια απειλή για την ανθρώπινη υγεία και σε αρκετές περιπτώσεις είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη πανδημιών στον ανθρώπινο πληθυσμό. Οι Ιοί κατέχουν ιδιάζουσα θέση στον κατάλογο των αιτιών που ευθύνονται για την ανάπτυξη σοβαρών παθολογικών φαινοτύπων που χαρακτηρίζουν ανθρώπινα νοσήματα, όπως τη νόσο του Έμπολα [Ebola Virus Disease (EVD)] (Ersching and Victora, 2019), το Άσθμα (Virgin, 2014) το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσοβιολογικής Ανεπάρκειας (AIDS), την Ιογενή Ηπατίτιδα B και C (Hepatitis B and C) (Yuen et al., 2018), τη Γρίπη (Iwasaki and Pillai, 2014) τον Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 1 [Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM)] (Foxman and Iwasaki, 2011) και τον Έρπη (Canny et al., 2014). Το πρόσφατο δραματικό παράδειγμα της εξάπλωσης του ιού SARS-CoV-2 μεταξύ των ανθρώπινων πληθυσμών και η επακόλουθη εμφάνιση της νόσου COVID-19 (Andreakos and Tsiodras, 2020; Xie et al., 2020), η οποία χαρακτηρίζεται από μεταβλητούς φαινοτύπους που κυμαίνονται από πυρετό και δυσκολία στην αναπνοή έως και οξεία αναπνευστική δυσχέρεια και θάνατο (Huang et al., 2020; Zhu et al., 2020), αποτελεί απόδειξη της προαναφερθείσας ικανότητας των ιών να προκαλούν επιβλαβείς επιδράσεις στην ανθρώπινη ομοιόσταση, την υγεία και τη μακροζωία. Το επιταχυνόμενο πρότυπο διασποράς των ιών προκαλεί σοβαρό αντίκτυπο στο παγκόσμιο σύστημα υγείας με εκτεταμένες επιπτώσεις για την κοινωνία και την παγκόσμια οικονομία. Οι ιοί εισέρχονται στον ανθρώπινο οργανισμό από πολλές εισόδους (επιθήλιο, επιφάνειες βλεννογόνου, αναπνευστικό σύστημα, πεπτικός σωλήνας) (Foxman and Iwasaki, 2011, Fenner 1996) και ακολουθεί η ανταγωνιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των μηχανισμών εισόδου του ιού και των αντί-ϊικών αμυντικών μηχανισμών του ξενιστή. Η αδυναμία του ανθρώπινου οργανισμού να αντιμετωπίσει το συγκεκριμένο περιβαλλοντικό ερέθισμα μέσω της στοχευμένης ενεργοποίησης των μηχανισμών αντί-ιϊκής ανοσολογικής απόκρισης (Foxman and Iwasaki, 2011) οδηγεί στην εκτενή διασπορά του ιού σε πολλά μέρη του σώματος. Υπάρχουν πολλά επίπεδα ρύθμισης και πληθώρα σχετικών παραγόντων ικανών να επηρεάσουν τα παραπάνω μοριακά γεγονότα συμβάλλοντας στην διεύρυνση της διακύμανσης του κινδύνου εκδήλωσης ασθένειας μεταξύ των ανθρώπων. Για παράδειγμα, ο ανοσοφαινότυπος του ξενιστή, η αλληλεπίδραση του ιού με άλλους μικροοργανισμούς και η γενετική προδιάθεση έχουν χαρακτηριστεί (Virgin, 2014) ως κρίσιμοι παράγοντες που καθορίζουν την ευαισθησία ή την ανθεκτικότητα των ανθρώπων σε συγκεκριμένες Ιϊκές μολύνσεις και συμβάλλουν στην μεταβλητότητα των παθολογικών φαινοτύπων που προκύπτουν. Σε κυτταρικό επίπεδο, η είσοδος των ιών στον οργανισμό οδηγεί σε επαναπρογραμματισμό του μεταγραφικού προφίλ των ανθρώπινων κυττάρων ενεργοποιώντας πληθώρα μονοπατιών μεταγωγής σήματος και εξειδικευμένους μεταγραφικούς παράγοντες (Agelopoulos and Thanos, 2006, Lavigne et al., 2015, Canny et al., 2014, Thanos and Maniatis 1995) που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων-στόχων. Αυτή η συνδυαστική μοριακή μεταβίβαση των περιβαλλοντικών ερεθισμάτων στον πυρήνα, επάγει την διαφορική έκφραση πολυάριθμων ανθρώπινων γονιδίων και συνεπώς την εγκαθίδρυση των ανθρώπινων αντί-ιϊκών προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης.Το ανθρώπινο γονιδίωμα διαμορφώθηκε στη διάρκεια της εξέλιξης για να δημιουργήσει το Homo sapiens (Rickels and Shilatifard, 2018) και ταξινομείται σε δύο κύρια τμήματα που ονομάζονται κωδικό (~2% και αποτελείται από περίπου 20.000 γονίδια) και μη κωδικό ή ρυθμιστικό (98% και αποτελείται από ένα πλήθος περιοχών, μέρος των οποίων καθοδηγεί την έκφραση των γονιδίων) (Agelopoulos and Thanos 2006, Shlyueva et al., 2014). Στον άνθρωπο, τα ~20.000 γονίδια ελέγχονται από ~106 ρυθμιστικά στοιχεία DNA (ENCODE Project Consortium, 2012) τα οποία οργανώνονται σε Cis Regulatory Modules (CRMs) (Agelopoulos et al., 2012, Agelopoulos et al., 2014) όπως οι ενισχυτές (enhancers), τα οποία είναι διεσπαρμένα στο γονιδίωμα και δρουν ως ροοστάτες της γονιδιακής έκφρασης. Ο κυρίαρχος ρόλος των ενισχυτών στην ανθρώπινη φυσιολογία διαφαίνεται από τις επιπτώσεις δομικών και βιοχημικών αλλαγών ή μεταλλάξεων της αλληλουχίας των ενισχυτών στην διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης των οργανισμών, όπως περιγράφεται στο πρόσφατο επιστημονικό πεδίο των ενισχυοπαθειών (Smith and Shilatifard, 2014, Rickels and Shilatifard, 2018). Ο όρος ενισχυοπάθειες χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό των παθολογικών φαινοτύπων που προέρχονται από διαταραχές στο πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης ως αποτέλεσμα μεταλλάξεων στη δομή και την αλληλουχία της μη-κωδικής μοίρας του ανθρώπινου γονιδιώματος. Η διαπίστωση ότι η πλειοψηφία των γενετικών πολυμορφισμών που συνδέονται με ασθένειες χαρτογραφούνται σε μη-κωδικές περιοχές του ανθρώπινου DNA (Hindorff et al., 2009) ενισχύει περαιτέρω τον κρίσιμο ρόλο των ενισχυτών στην φυσιολογία και παθοφυσιολογία των οργανισμών (Maurano et al., 2012). Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω, διαφαίνεται η ανάγκη για την σε βάθος μελέτη τόσο των κωδικών όσο και των μη κωδικών περιοχών του ανθρώπινου γονιδιώματος τα οποία σχετίζονται με την αντί-ιϊκή απόκριση των κυττάρων έτσι ώστε να διαλευκανθεί η μοριακή βάση ασθενειών που οφείλονται σε Ιϊκές μολύνσεις. Παρά την αλματώδη πρόοδο που έχει επιτευχθεί στο πεδίο της Μοριακής Επιδημιολογίας των ιών (Foxman and Iwasaki, 2011) καθώς και στη μελέτη των μοριακών μηχανισμών του μεταγραφικού επαναπρογραμματισμού των ανθρώπινων κυττάρων που μολύνονται από ιούς (Agelopoulos and Thanos, 2006, Lavigne et al., 2015, Canny et al., 2014), ένα μεγάλο μέρος του μοριακού σχεδιασμού της αντί-ιϊκής απόκρισης των ανθρώπινων κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Συνεπώς, η σε βάθος μελέτη των μοριακών μηχανισμών που κωδικοποιούνται από το ανθρώπινο γονιδίωμα και σχετίζονται με τις Ιϊκές μολύνσεις είναι αναγκαία για την διαλεύκανση της μοριακής βάσης ασθενειών που οφείλονται στις Ιϊκές μολύνσεις με μια σειρά βασικών ερωτημάτων να παραμένουν αναπάντητα:•Ποιο είναι το σύνολο των αντί-ιϊκών γονιδίων και ποια η κινητική της έκφρασής τους σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους θηλαστικών; Υπάρχει περίπτωση η ρύθμιση να πραγματοποιείται με διαφορετικό τρόπο σε διαφορετικές ομάδες αντί-ιϊκών γονιδίων;•Ποια είναι η ακριβής δομή της χρωματίνης σε περιοχές του γονιδιώματος όπως οι ενισχυτές και οι υπέρ-ενισχυτές (super-enhancers) στη διάρκεια της αντί-ιϊκής απόκρισης;•Με ποιο μοριακό μηχανισμό πραγματοποιείται η αποκρυπτογράφηση του σήματος της Ιϊκής μόλυνσης στον πυρήνα των κυττάρων των θηλαστικών και κατ’ επέκταση η εγκαθίδρυση του αντί-ιϊκού προγράμματος γονιδιακής έκφρασης; Δύναται περιοχές του γονιδιώματος όπως οι ενισχυτές και οι υπέρ-ενισχυτές να έχουν κομβικό ρόλο; Όπως είναι γνωστό οι ως άνω περιοχές του γονιδιώματος φιλοξενούν σε εκτεταμένο βαθμό μεταγραφικούς παράγοντες και ιστονικές τροποποιήσεις μετά την έναρξη της Ιϊκής μόλυνσης.Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η αποκρυπτογράφηση του ρόλου της δομής της χρωματίνης και των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδιώματος κατά την εξέλιξη των προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης που συνοδεύουν την απόκριση των κυττάρων στη διάρκεια Ιϊκών μολύνσεων σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους θηλαστικών. Η έρευνα για τη Διδακτορική Διατριβή θα εκπονηθεί σε αξιόπιστα πειραματικά συστήματα- μοντέλα τα οποία περιλαμβάνουν κυτταρικές σειρές θηλαστικών (ποντικού και ανθρώπου) εφαρμόζοντας ανταγωνιστική πειραματική στρατηγική που περιλαμβάνει ολιστική μελέτη σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και του μεταγραφώματος σε συνδυασμό με εφαρμογή εξελιγμένων μεθοδολογιών κυτταρικής βιολογίας, μοριακής βιολογίας, βιοχημείας, γονιδιωματικής και εκτεταμένη συνδυαστική βιοπληροφορική ανάλυση και υπολογιστική βιολογία. Η επιτυχής εκπόνηση της Διδακτορικής Διατριβής θα οδηγήσει στην κατασκευή του «Υπέρ-Άτλαντα» γονιδιωματικής της ρύθμισης της απόκρισης των κυττάρων των θηλαστικών υπό το καθεστώς της Ιϊκής μόλυνσης.