Μελέτη της έκφρασης του συστήματος RANKL/RANK/OPG στον καρκίνο του μαστού και θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Introduction: Despite advances in targeted therapies, resistance to anti-human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) treatments remains a significant challenge in breast cancer (BC) management. RANK/RANKL signaling pathway is implicated in HER2+ BC and promotes the development of resistance to anti-HER2 therapy, as well as immune evasion.Aim: This study aimed to evaluate the effectiveness of a triple-targeting regimen—Denosumab (D), Pertuzumab (P) and Trastuzumab (T)—for HER2-positive (HER2+) BC, and to assess the added value of immune checkpoint inhibitors (ICIs).Materials and Methods: A total of 120 paraffin-embedded breast cancer specimens (BC) were subjected to immunohistochemical analysis (IHC) to evaluate RANK (receptor activator of nuclear factor κΒ) expression and HER2 status. Staining intensity and the proportion of positive cells were quantified according to established scoring criteria. BT-474 HER2+ xenograft mouse models were used to assess the efficacy of combination therapies. Mice were treated with the D+T+P triple targeting regimen, and tumor volume and weight were monitored. HER2+ BC cells were cultured in a three -dimensional environment (3D) to investigate the effect of adding immune checkpoint inhibitors (ICIs), Nivolumab (N) and Ipilimumab (I), to the triple targeting regimen. Cell viability was measured following treatment by MTT assay. Expression levels of STAT3 and mTOR were analyzed in HER2+ and HER2- tissue samples via qRT-PCR to evaluate signaling pathway activation and potential mechanisms of resistance.Results : Immunohistochemical analysis revealed that HER2+ tumors displayed significantly elevated RANK expression compared to HER2 – tumors .Notably RANK+/HER2+ patients receiving triple targeting therapy exhibited a statistically significant improvement in disease free survival (DFS), whereas RANK-/HER2+ patients did not derive similar benefit. In BT-474 HER2+ xenografts, treatment with the D+T+P regimen resulted in robust reduction in both tumor volume and weight, confirming the enhanced anti-tumor efficacy of the combination therapy in vivo. Further evaluation revealed elevated STAT3 expression in HER2 – tissues and higher mTOR levels in HER2- compared to HER2+ samples, suggesting differential pathway activation across HER2 subtypes. Finally, 3D cell culture studies revealed that the addition of ICIs (Nivolumab and Ipilimumab) to the triple targeting led to a further decrease in HER2+BC cell viability, demonstrating a synergistic enhancement of the anti-tumor effect in vitro (D+T+P+N+I).Conclusions: These results underscore the pivotal role of the RANK–receptor activator of NF- κB ligand (RANKL) axis in tumor growth and immune regulation, supporting the use of triple-targeting therapy and suggesting enhanced benefits with the inclusion of ICIs to potentially overcome therapeutic resistance in HER2+ BC.

Εισαγωγή : Παρά την σημαντική εξέλιξη που παρατηρείται αναφορικά με τις στοχευμένες θεραπείες , η ανάπτυξη αντίστασης στις anti-HER2 θεραπείες παραμένει μια σημαντική πρόκληση στη διαχείριση του καρκίνου του μαστού (BC). Η σηματοδοτική οδός RANK/RANKL φέρεται να εμπλέκεται στον HER2+ καρκίνο μαστού και να προάγει την ανάπτυξη αντίστασης καθώς και την ανοσοδιαφυγή του όγκου.Σκοπός : H εν λόγω μελέτη έχει ως σκοπό να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα ενός τριπλού στοχευτικού σχήματος -Denosumab(D) ,Pertuzumab (P) και Trastuzumab (T)—στον ΗER2+ καρκίνο μαστού (HER2+BC) ,και να εκτιμήσει πιθανό προστιθέμενο όφελος από την συγχορήγηση των αναστολέων σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου(ICIs).Υλικά και Μέθοδοι : Συνολικά 120 block παραφίνης ασθενών με καρκίνο μαστού υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση (ICH) για την αξιολόγηση της έκφρασης του RANK (receptor activator of nuclear factor κΒ) και της κατάστασης του HER2. H ένταση της χρώσης και η αναλογία θετικών κυττάρων ποσοτικοποιήθηκαν σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης μοντέλα ποντικών xenograft BT-474 HER2+ με σκοπό την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των συνδυαστικών θεραπειών. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τριπλό συνδυασμό (D+T+P) και παρακολουθήσαμε την επίδραση στον όγκο καθώς και στο βάρος των όγκων . HER2+ κύτταρα BC καλλιεργήθηκαν σε τρισδιάστατο περιβάλλον (3D) για να εξεταστεί η επίδραση από την προσθήκη ICIs , Nivolumab (N) και Ipilimumab (I), επιπλέον του τριπλού στοχευτικού σχήματος. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε μέσω της μεθόδου ΜΤΤ . Τέλος, τα επίπεδα έκφρασης των STAT3 και mTOR αναλυθήκαν σε δείγματα HER2+ και ΗER2- BC με qRT-PCR, για την αξιολόγηση της ενεργοποίησης μετέπειτα σηματοδοτικών μονοπατιών και πιθανών μηχανισμών αντίστασης .Αποτελέσματα: Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση κατέδειξε ότι οι HER2 + BC εμφανίζουν στατιστικά σημαντική υψηλότερη έκφραση RANK σε σύγκριση με HER2- όγκους. Αξίζει να τονιστεί, ότι οι RANK+/HER2+ ασθενείς που έλαβαν τριπλή θεραπεία παρουσίασαν στατιστικά σημαντική βελτίωση στο διάστημα ελεύθερο νόσου ( DFS), ενώ οι RANK -/HER2+ ασθενείς δεν παρουσίασαν αντίστοιχο όφελος. Στα μοντέλα xenograft BT-474 HER2+, η θεραπεία με το τριπλό σχήμα D+T+P οδήγησε σε σημαντική μείωση του όγκου και του βάρους των όγκων, επιβεβαιώνοντας την ενισχυμένη αντινεοπλασματική δράση του συνδυασμού σε επίπεδο in vivo πειραμάτων. Πειράματα με qRT-PCR σε δείγματα φρέσκων ιστών ανέδειξαν αυξημένη έκφραση του STAT3 στους HER2- ιστούς και αντιστοίχως υψηλότερα επίπεδα έκφρασης mTOR σε HER2- σε σύγκριση με HER2+ δείγματα, υπονοώντας μια εναλλακτική ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών ανάλογα με την έκφραση ή μη του HER2. Τέλος, οι 3D κυτταρικές καλλιέργειες έδειξαν ότι η προσθήκη των ICIs (Nivolumab και Ipilimumab) στο τριπλό στοχευτικό σχήμα είχε σαν άμεση συνέπεια περαιτέρω μείωση της βιωσιμότητας των HER2+BC κυττάρων, υποδεικνύοντας για πρώτη φορά μια συνεργιστική ενίσχυση της αντινεοπλασματική δράσης μέσω πενταπλής στόχευσης (D+T+P+N+I) in vitro.Συμπεράσματα : Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν το καθοριστικό ρόλο του άξονα RANK-RANKL στην ογκογένεση, στην ανάπτυξη αντίστασης και στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης , ενισχύοντας την εφαρμογή στοχευμένων θεραπειών σε HER2+BC καθώς και τη δυνατότητα συνδυασμού τους με ανοσοθεραπεία.