Η επίδραση γηρασμένων και νέων ομόλογων κυττάρων στο μεσοσπονδύλιο δίσκο κονίκλων

Abstract

Degenerative disc disease (DDD) represents one of the most prevalent chronic, age-related spinal conditions, attributed to a complex interaction between genetic predisposition and environmental factors. Mesenchymal stem cell (MSC) therapy has emerged as a promising biological approach that targets the underlying pathophysiology of disc degeneration rather than merely alleviating symptoms. The purpose of this study was to evaluate the structural, macro- and microscopic changes in the nucleus pulposus and annulus fibrosus of the intervertebral disc (IVD) in rabbits following intradiscal injection of two different cell types: mesenchymal stem cells and senescent cells. A standardized degeneration protocol, using a 25G needle, was employed to induce disc degeneration at three lumbar levels (L1–L2, L2–L3, L3–L4) in sixteen (16) adult rabbits. Three (3) experimental disc groups were generated. In the first (A) discal group, following needle puncture, an intradiscal injection of culture medium was performed. In groups B and C, the same procedure was followed by injection of autologous mesenchymal stem cells and senescent cells, respectively. Mesenchymal stem cells were isolated from each rabbit’s adipose tissue and cultured under strictly sterile conditions prior to transplantation. Euthanasia was performed at the sixth (6th) and eighth (8th) postoperative weeks. The extracted disc samples were subjected to histological evaluation using hematoxylin–eosin (H&E) and Alcian Blue staining, as well as immunohistochemical analysis for the markers Collagen type II, Aggrecan (extracellular matrix component), Ki67 (cell proliferation marker), and p16 (cellular senescence marker). At the 6th week (first experimental phase), Group B exhibited enhanced regenerative activity, with increased expression of Collagen type II, Aggrecan, and Ki67 (p < 0.001). In contrast, Group C demonstrated pronounced degenerative alterations, with elevated expression of p16, indicating advanced cellular senescence. At day 57 (8th week, second phase), similar to the first phase, the group treated with young mesenchymal cells maintained and further enhanced its biological activity, showing a continued increase in the expression of Collagen type II, Aggrecan, and Ki67 (p < 0.01), while p16 expression remained low. Conversely, Group C showed further deterioration of its molecular profile, with increased p16 expression (p < 0.01) and persistently low levels of the other markers. The present study highlights the beneficial effects of mesenchymal stem cell injection in a rabbit model of intervertebral12disc degeneration, demonstrating enhanced regenerative activity as early as the sixth postoperative week.

Η εκφυλιστική νόσος του μεσοσπονδύλιου δίσκου (ΜΣΔ) αποτελεί μία από τις κυριότερες χρόνιες, ηλικιακά εξαρτώμενες παθήσεις. Η εκφύλιση του ΜΣΔ οφείλεται σε αλληλεπίδραση μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Η κυτταρική έγχυση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων, ως βιολογική θεραπεία, έχει ενισχύσει σε μεγάλο βαθμό την αντιμετώπιση της νόσου, στοχεύοντας στην παθοφυσιολογία αυτής και όχι στην συμπτωματολογία. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση των δομικών, μακρό- και μικροσκοπικών αλλαγών του πηκτοειδούς πυρήνα και του ινώδους δακτυλίου σε δίσκους κονίκλων μετά από έγχυση δύο κυτταρικών ομάδων, νεαρών και γηρασμένων μεσεγχυματικών στελεχιαίων απομονωμένων από το λιπώδη ιστό κονίκλου. Με βάση ένα καθορισμένο πρωτόκολλο πρόκλησης εκφυλιστικών αλλοιώσεων, μέσω της εισαγωγής βελόνης 25Gauge (G), πραγματοποιήθηκε πειραματική μελέτη σε τρία επίπεδα ΜΣΔ (Ο1-Ο2, Ο2-Ο3, Ο3-Ο4) δεκαέξι (16) ενήλικων κονίκλων. Από το πείραμα προέκυψαν τρεις πειραματικές ομάδες δίσκων. Στην πρώτη δισκική ομάδα πραγματοποιήθηκε εκφύλιση του δίσκου, η οποία διενεργήθηκε με την εισαγωγή βελόνης 25G στο δίσκο και έγχυση θρεπτικού υλικού κυτταροκαλλιέργειας (Ομάδα Α). Στη δεύτερη δισκική ομάδα με την ίδια διαδικασία ακολούθησε έγχυση νεαρών μεσεγχυματικών στελεχιαίων κυττάρων από λιπώδη ιστό κονίκλου(Ομάδα Β) και στην τρίτη (Ομάδα Γ) δισκική ομάδα μετά την εκφύλιση εισήχθησαν γηρασμένα μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα από λιπώδη ιστό κονίκλου (Ομάδα Γ). Η διαδικασία καλλιέργειας των μεσεγχυματικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό αυστηρά στείρες συνθήκες με απομόνωση αυτών από τον λιπώδη ιστό του ίδιου κονίκλου. Η ευθανασία των πειραματοζώων πραγματοποιήθηκε κατά την 6η και 8η μετεγχειρητική εβδομάδα. Τα εξαιρεθέντα δισκικά δείγματα υποβλήθηκαν σε ιστολογική αξιολόγηση με χρώσεις αιματοξυλίνης-ηωσίνης (hematoxylin and eosin - HE) και Alcian Blue, καθώς και σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση για τους δείκτες Κολλαγόνο τύπου ΙΙ, Αγγρεκάνης, Ki67 (δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού) και του p16 (δείκτης κυτταρικής γήρανσης). Ήδη από την 6η μετεγχειρητική εβδομάδα (1η πειραματική φάση), η Ομάδα Β παρουσίασε ενισχυμένη αναγεννητική ικανότητα, με αυξημένη έκφραση κολλαγόνου τύπου ΙΙ, αγγρεκάνης και Ki67 (p < 0,001). Αντίθετα, η Ομάδα Γ εμφάνισε έντονες εκφυλιστικές μεταβολές, με αυξημένη έκφραση του δείκτη p16, γεγονός που υποδηλώνει προχωρημένη κυτταρική10γήρανση. Την 8η εβδομάδα (2η πειραματική φάση), όπως και στην 1η φάση η ομάδα των νεαρών κυττάρων διατήρησε και ενίσχυσε την αναπλαστική της ικανότητα, με περαιτέρω αύξηση της έκφρασης κολλαγόνου ΙΙ, αγγρεκάνης και Ki67 (p < 0,01), ενώ η έκφραση του p16 παρέμεινε περιορισμένη. Αντίθετα η ομάδα Γ παρουσίασε περαιτέρω επιδείνωση του μοριακού της προφίλ, με αυξημένη έκφραση του δείκτη p16 (p < 0,01) και διατήρηση των υπολοίπων δεικτών σε χαμηλά επίπεδα. Η παρούσα μελέτη παραθέτει τα θετικά αποτελέσματα της έγχυσης των μεσεγχυματικών στελεχιαίων κυττάρων απομονωμένων από το λιπώδη ιστό κονίκλου σε ένα ζωικό μοντέλο εκφύλισης του μεσοσπονδύλιου δίσκου, καθώς ενισχύεται η αναγεννησιακή ικανότητα από την 6η κιόλας εβδομάδα.