Διερεύνηση του ρόλου της ακτιβίνης στα αποφρακτικά νοσήματα των αεραγωγών

Abstract

Activin A is a member of the TGF-β superfamily and is a key factor in airway inflammation. This protein and its binding protein, Follistatin, are widely expressed and their production is increased in many acute and chronic inflammatory conditions. Increasing evidence implicates activin A in the process of airway remodeling. The synthesis and release of activin is activated by inflammatory cytokines, Toll-like receptor ligands, and oxidative stress. Activin interacts with heterodimeric serine/threonine kinase receptor complexes to activate SMAD transcription factors and MAP kinase signaling pathways, which mediate inflammation, stress, and immunity. Activin-A can promote inflammation by activating the production of inflammatory mediators such as interleukins IL-1β, IL-6, TNF, and NO (1, 2). However, other studies show the opposite, that activin can inhibit inflammation. Clearly, the regulation of the immunoregulatory effect of Activin A is complex and dependent on anatomical location, cell type, and phase of the immune response. It has also been found that overexpression of Activin A in mouse lungs leads to lung pathology similar to that of patients with ALI/ARDS (3). Activin A is overexpressed in bronchoalveolar lavage of patients with ARDS at levels comparable to those produced in animal models. Activin A, in terms of its actions in respiratory physiology, appears to have a role in regulating surfactant synthesis and in the development of a procoagulant state. Therapeutic neutralization of activin A attenuates the pathology caused by ectopic or endogenous expression of activin A, which strongly suggests that activin A inhibitors may provide therapeutic benefit in patients with ALI/ARDS. However, the studies that have been conducted so far are only in experimental animals in vitro. Further research is required to study this molecule and to document its role in the pathophysiology of obstructive airway diseases in vivo.Our aim was to determine the levels of Activin expression in patients with COPD, ACO and Asthma at different time points for each patient, both during periods of disease exacerbation and at rest.We hypothesized that finding the expression levels of activin in sputum and blood serum of patients with COPD and patients with Asthma and ACO, at specific times in the course of the disease would allow us to identify: A. The exact expression of activin in the natural course of each disease separately (in exacerbation and at rest). B. To distinguish any differences/similarities between the diseases. C. To determine possible biological indicators of severity of exacerbation or even prognosis of the natural course of the above diseases. Our study included 54 patients in total, aged fourteen years and older, former and current smokers, who were hospitalized at the Pulmonary Clinic of the Heraklion University Hospital due to exacerbation of COPD, ACO or exacerbation of Bronchial Asthma. All subjects underwent routine pulmonary function tests, which included: pre- and post-bronchodilator spirometry, static volume measurements, as well as carbon monoxide diffusion capacity measurements, arterial blood gases, and chest X-ray. Age, height, weight, sex, and comorbidities were recorded. The type and severity of exacerbation, as well as the frequency of exacerbations of the disease in the last 2 years before entry into the study were recorded. Written informed consent was obtained from all patients participating in the study. Spontaneous sputum and peripheral blood were collected from each patient on the 1st day of exacerbation, on the day of discharge from the hospital, 1 month and 4 months after the exacerbation, if at rest, otherwise at each subsequent exacerbation. Although the collection of sputum samples was spontaneous, given the good repeatability of the procedure in each collection as well as the fact that at least four samples were collected in the same way in each patient at defined time periods, they ensure satisfactory sensitivity and specificity of our study samples. The sputum was centrifuged immediately and following a certified protocol, both the supernatant and the underlying part of the samples were stored in separate containers at -80 degrees Celsius. A peripheral blood sample was also taken from each patient, which was centrifuged and the supernatant was stored in eppedorf bottles at -80 degrees Celsius until the activin measurement was performed. In case of a new exacerbation and hospitalization of a patient at any time point from the 1st exacerbation within the total follow-up period, sputum and blood serum samples were collected again and new activin values ​​were measured. The maximum number of new exacerbations recorded for each patient was set at four. Activin levels were measured in the sputum and peripheral blood of the patients using the ELISA method, at four different time points per patient (1st day of exacerbation, day of discharge from the hospital, 1 and 3 months later at regular follow-up). The above findings were correlated with individual history, comorbidities, risk of exacerbations and results of lung function tests and we are now in search of the first correlations of activin levels with the above data.Pooled analyses showed that Activin A levels in sputum samples are significantly higher during exacerbation and then decrease after 4 months in both stable COPD (p = 0.013) and asthma (p = 0.016) or ACOS (p = 0.004), while in COPD patients who experienced at least one new exacerbation during this time period, Activin A levels in sputum remained similar at all time points of the study. In contrast, Activin A levels in serum of patients do not significantly decrease after exacerbation but rather increase during the 1 and 4 month reference periods (t1) in COPD and ACO. Overall, Activin A levels did not show significant differences between the COPD, asthma and ACO groups at any time point of the study in sputum or serum. However, baseline Activin A levels in sputum at the 4-month time point were significantly higher in COPD patients with at least one exacerbation compared to COPD patients without a new exacerbation (p = 0.033), with asthma (p = 0.013) or with ACO (p = 0.005). In conclusion, we can say based on our results that sputum Activin A levels increase during acute exacerbation in patients with chronic obstructive pulmonary diseases, while remaining elevated in serum even at baseline.

Η ακτιβίνη Α είναι μέλος της υπερ-οικογένειας του TGF-β και αποτελεί παράγοντα «κλειδί» για τη φλεγμονή των αεραγωγών. Η πρωτεΐνη αυτή και η πρωτεΐνη δέσμευσης της, η Φολλιστατίνη, εκφράζονται ευρέως και η παραγωγή τους αυξάνεται σε πολλές οξείες και χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Ολοένα και περισσότερα στοιχεία ενοχοποιούν την ακτιβίνη Α, στη διαδικασία του «remodeling» των αεραγωγών. Η σύνθεση και η απελευθέρωση της ακτιβίνης ενεργοποιείται από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, συνδέσμους των Toll-like υποδοχέων και το οξειδωτικό stress. Η ακτιβίνη αλληλεπιδρά με τα συμπλέγματα των ετεροδιμερών υποδοχέων serine/threonine kinase για να ενεργοποιήσουν τους παράγοντες μεταγραφής SMAD και τα μονοπάτια σηματοδότησης της MAP κινάσης, τα οποία μεσολαβούν στη φλεγμονή, το stress και την ανοσία. Η ακτιβίνη-Α μπορεί να προωθήσει τη φλεγμονή ενεργοποιώντας την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως των ιντερλευκινών IL-1β, IL-6, του TNF και του NO (1, 2).Όμως άλλες μελέτες δείχνουν το αντίθετο, ότι δηλαδή η ακτιβίνη μπορεί να αναστείλει τη φλεγμονή. Σαφώς η ρύθμιση της άνοσο-ρυθμιστικής επίδρασης της Ακτιβίνης Α είναι πολύπλοκη και εξαρτώμενη από την ανατομική θέση, τον τύπο κυττάρου και τη φάση της ανοσολογικής απάντησης. Έχει επίσης βρεθεί ότι η υπερέκφραση της ακτιβίνης Α σε πνεύμονες ποντικών οδηγεί σε παθολογία των πνευμόνων παρόμοια με αυτή ασθενών με ALI/ARDS (3). Η ακτιβίνη Α υπερεκφράζεται σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με ARDS σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά που παρήχθησαν στα μοντέλα ζώων. Η ακτιβίνη Α όσο αφορά τις δράσεις της στην αναπνευστική φυσιολογία, φαίνεται ότι έχει ρόλο στη ρύθμιση της σύνθεσης του επιφανειοδραστικού παράγοντα και στην ανάπτυξη προ-πηκτικής κατάστασης. Η θεραπευτική εξουδετέρωση της ακτιβίνης Α εξασθενεί την παθολογία που προκαλείται από την έκτοπη ή ενδογενής έκφραση της ακτιβίνης Α, γεγονός που υποδεικνύει ισχυρά ότι αναστολείς της ακτιβίνης Α μπορεί να παρέχουν θεραπευτικό όφελος σε ασθενείς με ALI/ARDS. Οι μελέτες όμως που έχουν διεξαχθεί έως τώρα είναι μόνο σε πειραματόζωα in vitro. Παραπάνω έρευνα απαιτείται για την μελέτη αυτού του μορίου και την τεκμηρίωση του ρόλου του στην παθοφυσιολογία των αποφρακτικών νοσημάτων του αναπνευστικού in vivo.Στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε τα επίπεδα της έκφρασης της Ακτιβίνης σε ασθενείς με ΧΑΠ, ACO και Άσθμα σε διαφορετικές χρονικές στιγμές για κάθε ασθενή, τόσο κατά τις περιόδους έξαρσης της νόσου όσο και σε ηρεμία.Υποθέσαμε ότι η ανεύρεση των επιπέδων έκφρασης της ακτιβίνης σε πτύελα και ορό αίματος ασθενών με ΧΑΠ και ασθενών με Άσθμα και ΑCO, σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές της πορείας της νόσου θα μας επέτρεπε να εντοπίσουμε:A. Tην ακριβή έκφραση της ακτιβίνης στην φυσική πορεία της κάθε νόσο ξεχωριστά (στην παρόξυνση και την ηρεμία).B. Να διακρίνουμε τυχόν διαφορές/ομοιότητες ανάμεσα στα νοσήματα.C. Να προσδιορίσουμε πιθανούς βιολογικούς δείκτες βαρύτητας της παρόξυνσης ή και πρόγνωσης της φυσικής πορείας των ανωτέρω νοσημάτων. Στην μελέτη μας συμπεριλήφθησαν 54 ασθενείς συνολικά, ηλικίας δεκατεσσάρων ετών και άνω, πρώην και νυν καπνιστές, οι οποίοι νοσηλεύτηκαν στην Πνευμονολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηράκλειου λόγω παρόξυνσης ΧΑΠ, ACO ή παρόξυνσης Βρογχικού Άσθματος. Όλα τα άτομα υποβλήθηκαν σε εξετάσεις ρουτίνας της πνευμονικής λειτουργίας, που περιελάμβανε: σπιρομέτρηση πρό και μετά βρογχοδιαστολή, μέτρηση στατικών όγκων, καθώς και μέτρηση της ικανότητας διάχυσης του μονοξειδίου του άνθρακα, αέρια αρτηριακού αίματος, και ακτινογραφία θώρακα. Η ηλικία, το ύψος, το βάρος, το φύλο, και οι συνοσηρότητες καταγράφηκαν. Το είδος και η βαρύτητα της παρόξυνσης, καθώς και η συχνότητα των παροξύνσεων της νόσου τα τελευταία 2 έτη πριν την είσοδο στην μελέτη καταγραφήκαν. Έγγραφη συναίνεση κατόπιν ενημέρωσης αποκτήθηκε από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη. Από τον κάθε ασθενή ελήφθησαν αυθόρμητα πτύελα και περιφερικό αίμα την 1η ημέρα της παρόξυνσης, την ημέρα εξόδου από το νοσοκομείο, 1 μήνα και 4 μήνες μετά από την παρόξυνση, εφόσον βρίσκεται σε ηρεμία, διαφορετικά σε κάθε επόμενη παρόξυνση. Αν και η συλλογή δειγμάτων πτυέλων δεν πραγματοποιήθηκε μετά από πρόκληση, δεδομένου της καλής επαναληψιμότητας της διαδικασίας σε κάθε συλλογή καθώς και το γεγονός ότι σε κάθε ασθενή σύλλεχθησαν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο τουλάχιστον τέσσερα δείγματα σε καθορισμένες χρονικές περιόδους εξασφαλίζουν ικανοποιητική ευαισθησία και ειδικότητα των δειγματων μελέτης μας. Τα πτύελα φυγοκεντρήθηκαν άμεσα και ακολουθώντας πιστοποιημένο πρωτόκολλο τόσο το υπερκείμενο όσο και το υποκείμενο μέρος των δειγμάτων αποθηκεύτηκαν σε ξεχωριστά δοχεία στους -80 βαθμούς Κελσίου. Από τον κάθε ασθενή ελήφθη επίσης ένα δείγμα περιφερικού αίματος το οποίο φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο μέρος φυλάχθηκε σε μπουκαλάκια eppedorfs στους -80 βαθμούς κελσίου μέχρι να γίνει η μέτρηση της ακτιβίνης. Σε περίπτωση νέας παρόξυνσης και νοσηλείας ενός ασθενούς σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο από την 1η παρόξυνση εντός του συνολικού διαστήματος παρακολούθησης, πραγματοποιήθη εκ νέου συλλογή δειγμάτων πτυέλων και ορού αίματος και νέες μετρήσεις τιμών ακτιβίνης. Η μέγιστη καταγραφή νέων παροξύνσεων για κάθε ένα ασθενή ορίστηκε σε τέσσερις. Τα επίπεδα της ακτιβίνης μετρήθηκαν στα πτύελα και στο περιφερικό αίμα των ασθενών με την μέθοδο ELISA, σε τέσσερα διαφορετικά χρονικά σημεία ανά ασθενή (1η ημέρα παρόξυνσης, ημέρα εξόδου από το νοσοκομείο, 1 και 3 μήνες μετά σε τακτικό επανέλεγχο). Τα παραπάνω ευρήματα συσχετισθήκαν με το ατομικό ιστορικό, τις συνοσηρότητες, τον κίνδυνο παροξύνσεων και τα αποτελέσματα των λειτουργικών δοκιμασιών του πνεύμονα και πλέον βρισκόμαστε στην αναζήτηση των πρώτων συσχετίσεων των επιπέδων ακτιβίνης με τα παραπάνω δεδομένα.Oι αθροιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι τα επίπεδα Ακτιβίνης A στα δείγματα πτυέλων είναι σημαντικά υψηλότερα κατά την παρόξυνση και στη συνέχεια μειώνονται μετά από 4 μήνες τόσο σε σταθερή ΧΑΠ (p = 0.013) όσο και στο άσθμα (p = 0.016) ή ACOS (p = 0.004) , ενώ σε ασθενείς με ΧΑΠ που εμφάνισαν έστω μια νέα παρόξυνση στο χρονικό διάστημα αυτό, τα επίπεδα ακτιβίνης Α στα πτύελα παρέμειναν παρόμοια σε όλα τα χρονικά σημεία της μελέτης. Αντίθετα, τα επίπεδα της Ακτιβίνης Α στον ορό των ασθενών δεν μειώνονται σημαντικά μετά από την παρόξυνση αλλά μάλλον αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια των περιόδων αναφοράς 1 και 4 μηνών (t1) σε COPD και ACO. Συνολικά, τα επίπεδα Ακτιβίνης Α δεν εμφάνισαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων COPD, άσθματος και ACO σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο της μελέτης σε πτύελα ή ορό. Ωστόσο, τα επίπεδα της αναφοράς της Ακτίβινης Α στα πτύελα στο χρονικό σημείο των 4 μηνών ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με ΧΑΠ με τουλάχιστον μία έξαρση σε σχέση με τους ασθενείς ΧΑΠ χωρίς νέα παρόξυνσης (p = 0,033), με άσθμα (p = 0,013) ή με ACO (p = 0,005). Συμπερασματικά, μπορούμε να πούμε με βάση τα αποτελέσματα μας ότι τα επίπεδα πτυέλων της Ακτιβίνης Α αυξάνονται κατά τη διάρκεια οξείας παρόξυνσης σε ασθενείς με χρόνιες αποφρακτικές πνευμονικές ασθένειες, ενώ παραμένουν αυξημένα στον ορό ακόμα και κατά το σημείο αναφοράς.