Η χρήση των τερπενίων εναντίον των κομβονηματωδών (Meloidogyne javanica) και η μελέτη της συμπεριφοράς τους στη μικροβιακή κοινότητα του εδάφους: -: -

Abstract

Root-knot nematodes (RKN; Meloidogyne spp.) cause significant economic losses in a wide range of important vegetable crops cultivated in open fields and greenhouses. They are considered among the most damaging agricultural pests worldwide, due to their wide distribution and their major impact on vegetable production. Until recently, the management of root-knot nematodes was mainly based on the use of synthetic nematicides that were commercially available. However, their indiscriminate and prolonged use has resulted in toxicity to non-target organisms, such as soil microorganisms, along with hazardous effects on the environment and growing concerns about human health. Due to these negative impacts, several widely used synthetic nematicides have been banned or are under re-evaluation. In response to current environmental restrictions, there is an increasing need to develop alternative control methods based on natural plant-derived compounds - products of secondary plant metabolism - that are safer, more eco-friendly and minimize the residual effects. The aim of the present study was to evaluate the effectiveness of geraniol, eugenol, thymol, and carvacrol against Meloidogyne javanica at all developmental stages of its life cycle (J2 juveniles, eggs, and egg masses), as well as to assess their impact on the soil microbial community. The first aim of the study was to evaluate (1) the nematicidal and nematostatic activity of the four terpenes on second-stage juveniles (J2) of M. javanica, (2) the differentiation of the four terpenes inhibition on undeveloped eggs, (3) the hatch inhibition activity of eugenol in egg masses, (4) the effect of contact and vapor activity of the four terpenes on M. javanica infectivity, (5) the effect of the four terpenes on the development of M. javanica, and (6) the effect of sublethal doses of the four terpenes on M. javanica infectivity.Regarding the nematicidal activity of the four terpenes against J2 of M. javanica, exposure to 1000 ppm terpene solutions for 12 hours resulted in 81–100% of paralyzed juveniles. The highest paralysis activity was observed for the terpene carvacrol, which, at a dose of 125 ppm, paralyzed 65.3% of J2s after 96 hours of exposure. The effect of terpene solutions on egg development was studied at five different concentration levels, and the results showed a significant inhibition of egg differentiation at the higher concentrations. At a concentration of 1000 ppm, eugenol, carvacrol, geraniol, and thymol inhibited egg differentiation by 77%, 58%, 56%, and 35%, respectively. Additionally, a decrease in J2 hatching from egg masses submerged in terpene solutions was observed across all treatments. At a concentration of 1000 ppm, significantly fewer J2 were recorded, with hatching ranging from 77.95% to 84.35%. The contact and fumigant effects of four terpenes against M. javanica J2 were evaluated in nematode-infested soil under two temperature levels. All terpenes, through their contact activity, exhibited strong nematicidal activity, with mortality ranging from 88% to 99% at a dose of 1000 ppm. However, no significant fumigant nematicidal activity was observed for any of the terpenes. Incorporation of terpene solutions into the soil also significantly reduced the number of M. javanica females. Among the terpenes tested, carvacrol was the most effective, followed by geraniol, thymol, and eugenol. The invasion of nematodes into plant roots was affected by treating J2 with sublethal concentrations of terpenes. The results demonstrated that increasing the exposure time significantly reduced the number of female nematodes in the roots. Among the terpenes tested, carvacrol was the most effective in reducing female numbers, followed by eugenol, geraniol, and thymol. The synergistic and additive interactions of the four terpenes were further investigated by comparing the nematicidal activity of each individual compound with that of their binary mixtures. All possible binary combinations were tested, with the carvacrol/thymol mixture exhibiting the highest nematicidal activity against M. javanica J2. The results indicated that none of the combinations showed antagonistic interactions, suggesting additive or synergistic effects in all cases. The impact of geraniol, eugenol, thymol, and carvacrol on the soil microbial community was assessed using the optimized Phospholipid Fatty Acid (PLFA) extraction protocol, as described by Papadopoulou et al. (2011). The analysis showed that geraniol, eugenol, and thymol did not significantly influence the structure of the soil microbial community. PLFA assay indicated that carvacrol (≥ 250 ppm) led to a significant increase in Gram-negative bacteria, fungi, and eukaryotic organisms.

Οι κομβονηματώδεις (RKN; Meloidogyne spp.) ανήκουν στα πιο διαδεδομένα γένη φυτοπαρασιτικών νηματωδών και αποτελούν μία από τις κύριες αιτίες οικονομικής απώλειας στην αγροτική παραγωγή σε παγκόσμια κλίμακα. Η αντιμετώπισή τους, τα προηγούμενα χρόνια, βασιζόταν κυρίως στη χρήση εμπορικά διαθέσιμων συνθετικών νηματωδοκτόνων, τόσο σε εθνικό όσο και σε παγκόσμιο επίπεδο. Ωστόσο, η εντατική και μακροχρόνια χρήση τους έχει προκαλέσει σημαντικές αρνητικές επιδράσεις σε οργανισμούς μη-στόχους, όπως οι μικροοργανισμοί του εδάφους, στο περιβάλλον και, γενικότερα, στην ανθρώπινη υγεία. Οι επιπτώσεις αυτές οδήγησαν στην απόσυρση ή την αναθεώρηση της έγκρισης πολλών ευρέως χρησιμοποιούμενων συνθετικών νηματωδοκτόνων, εντείνοντας την ανάγκη για ανάπτυξη νέων μέσων καταπολέμησης των νηματωδών, βασισμένων σε φυσικές ουσίες φυτικής προέλευσης - προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των φυτών – με βελτιωμένα και φιλικά προς το περιβάλλον χαρακτηριστικά. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αντιμετώπιση του είδους Meloidogyne javanica σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του βιολογικού του κύκλου (J2, ωά, ωόσακοι) με τη χρήση γερανιόλης, ευγενόλης, θυμόλης και καρβακρόλης, καθώς και η διερεύνηση της επίδρασής τους στην εδαφική μικροβιακή κοινότητα.Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με σκοπό την αξιολόγηση: (1) της νηματωδοκτόνου και νηματωδοστατικής δράσης των τεσσάρων τερπενίων σε J2 του M. javanica, (2) της επίδρασης των τεσσάρων τερπενίων στη διαφοροποίηση αδιαφοροποίητων ωών M. javanica, (3) της δράσης των τεσσάρων τερπενίων στην εκκόλαψη των ωών, 4) της νηματωδοκτόνου και της δια των ατμών δράσης των τεσσάρων τερπενίων σε έδαφος μολυσμένο απο νηματώδεις, 5) της επίδρασης των τεσσάρων τερπενίων στην ανάπτυξη των νηματωδών M. javanica και 6) της επίδρασης των τεσσάρων τερπενίων σε υποθανατηφόρες συγκεντρώσεις στην ανάπτυξη των νηματωδών M. javanica. Όσον αφορά στην πρόκληση θνησιμότητας, μετά από εμβάπτιση των J2 στα διαλύματα και των τεσσάρων τερπενίων, παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας (81 – 100%) στην περίπτωση και των τεσσάρων τερπενίων, ακόμη και μετά από εμβάπτιση των J2 για 12 ώρες στα διαλύματα συγκέντρωσης 1000 ppm των τερπενίων. Το πλέον δραστικό τερπένιο ήταν αυτό της καρβακρόλης, η οποία προκάλεσε 65.3% θνησιμότητα στους M. javanica όταν εφαρμόστηκε στη συγκέντρωση των 125 ppm μετά από 96 ώρες εμβάπτιση. Η επίδραση των τερπενίων στην πορεία διαφοροποίησης των ωών μελετήθηκε με εμβάπτιση των ωών M. javanica σε διαλύματα τους σε πέντε επίπεδα συγκεντρώσεων και από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε σημαντική αναστολή της διαφοροποίησης των ωών στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το μεγαλύτερο ποσοστό αναστολής διαφοροποίησης των ωών M. javanica καταγράφηκε στην περίπτωση της ευγενόλης (77%), ακολούθησαν η καρβακρόλη και η γερανιόλη (58% και 56%, αντίστοιχα) και τέλος η θυμόλη (35%), στη συγκέντρωση των 1000 ppm. Στα πειράματα επίδρασης των τερπενίων στην εκκόλαψη ωών M. javanica σε όλες τις περιπτώσεις διαπιστώθηκε ισχυρή νηματωδοκτόνος δράση, αφού παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην εκκόλαψη των ωών, που κυμάνθηκε από 77.95 έως 84.35%, στη συγκέντρωση των 1000 ppm. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων της νηματωδοκτόνου και της δια των ατμών δράσης των τεσσάρων τερπενίων, μετά από εφαρμογή τους σε τεχνητά μολυσμένο έδαφος με J2 σε δύο επίπεδα θερμοκρασίας, όλα τα τερπένια παρουσίασαν νηματωδοκτόνο εξ επαφής δράση. Τα ποσοστά θνησιμότητας και για τα τέσσερα τερπένια κυμάνθηκε από 88 έως 99% στα 1000 ppm. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της εξ επαφής βιοδοκιμής, τα τέσσερα τερπένια δεν παρουσίασαν σημαντική δια των ατμών δράση. Η επίδραση της ενσωμάτωσης των διαλυμάτων τερπενίων στο έδαφος οδήγησε επίσης σε μείωση του αριθμού των θηλυκών ατόμων M. javanica, με αποτελεσματικότερο τερπένιο να αποδεικνύεται η καρβακρόλη, και να ακολουθούν με φθίνουσα σειρά η γερανιόλη, η θυμόλη και η ευγενόλη. Η εφαρμογή των τερπενίων σε υποθανατηφόρες συγκεντρώσεις για τη μείωση του αριθμού των θηλυκών ατόμων στις ρίζες των φυτών έδειξε ότι ο αυξανόμενος χρόνος εμβάπτισης των J2 στα διαλύματα τερπενίων μείωσε σημαντικά τον αριθμό των θηλυκών νηματωδών. Το πιο δραστικό τερπένιο στη μείωση του αριθμού των θηλυκών ατόμων στις ρίζες των φυτών ήταν επίσης η καρβακρόλη, ενώ ακολούθησαν η ευγενόλη, η γερανιόλη και η θυμόλη.Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η συνεργιστική και προσθετική αλληλεπίδραση των τεσσάρων τερπενίων, συγκρίνοντας την επίδραση κάθε μεμονωμένης ουσίας με εκείνη των δυαδικών μιγμάτων (συνδυασμοί δύο ουσιών). Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε σύγκριση της δράσης των τερπενίων σε όλους τους πιθανούς συνδυσμούς μεταξύ τους. Το μίγμα των τερπενίων καρβακρόλης/θυμόλης εμφάνισε τη μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα έναντι των J2 του M. javanica. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι όλοι οι συνδυασμοί των τεσσάρων τερπενίων παρουσίασαν μη ανταγωνιστική δράση κατά των νηματωδών M. javanica. Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της γερανιόλης, της ευγενόλης, της θυμόλης και της καρβακρόλης στην εδαφική μικροβιακή κοινότητα, με τη βελτιστοποιημένη μέθοδο ανάλυσης των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων (PLFAs) όπως περιγράφεται από Papadopoulou et al., 2011. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι η γερανιόλη, η ευγενόλη και η θυμόλη δεν επηρέασαν σημαντικά την μικροβιακή κοινότητα του εδάφους. Επιπλέον, η καρβακρόλη, σε συγκεντρώσεις ≥ 250 ppm, προκάλεσε αύξηση των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, των μυκήτων και των ευκαρυωτικών οργανισμών.