Single cell transcriptomic mapping of cell state identities in lung aging, injury and repair

Abstract

Publication I: In order to study age related alterations at cell type level we employed microfluidic based single-cell RNA transcriptomics on whole lung homogenates of young (3 months old) and aged (24 months old) mice. These data were coupled with bulk proteomic and transcriptomic data in an attempt to create an atlas of the aged murine lung that represents a reference tool available for researchers of lung biology and aging. We examined gene expression patterns for over 30 cell types and identified changes with regard to aging in all cell types. Furthermore, we showed that aging is accompanied by an increase in transcriptional noise, a phenomena that had very recently been identified in human, hinting that this feature could in fact be a global hallmark of aging that possibly affects most cell types in both humans and mice. Publication I in addition to all the findings that refer to the known hallmarks of aging, highlights a rather novel alteration of the stem cells of the alveolar epithelial barrier that had not been previously extensively studied. Our observations of increased cholesterol biosynthesis and high neutral lipid content in AEC2s of aged mice may refer to previous studies showing the lipid composition of the pulmonary surfactant being changed with age. In our study we report a strong correlation between the aged AEC2 phenotype and that of Insig1/2 knockout mice that accumulate neutral lipids, resulting in lipotoxicity-driven lung inflammation. This indicated that, to some extent, the observed chronic inflammation in the aged lung could be 16 influenced by deregulated lipid homeostasis. In addition, other hallmarks of aging such as epithelial senescence may be contributing to the inflammatory phenotype observed, since AEC2 specific deletion of telomerase in mice has been shown to promote the development of a pro-inflammatory tissue microenvironment, resulting to a decreased ability of resolving any acute lung injury. Finally, up to date most studies of lung aging have focused primarily on accumulating fibroblasts and impaired alveolar epithelium. Through our unbiased approach we have revealed compositional changes in other respiratory compartments discovering a clear alteration of the airway epithelial cells during aging which results in an overall increase in the number of ciliated cells aligning the airways. Publication II: In this study we attempted to investigate the kinetics of murine lung regeneration at the single cell level using the bleomycin murine injury model. We resolved the gene expression changes within 28 cell types focusing primarily on the alveolar and airway epithelium. Our work describes how airway and alveolar stem cells initially converge onto a novel Krt8+ transitional stem cell state, termed Krt8+ alveolar differentiation intermediate (ADI), prior to initiating proper regeneration of AEC1s. We identified these Krt8+ ADI cells in multiple mouse lung injury models as well as in human lung fibrosis. The Krt8+ ADI cells feature hallmarks of EMT, senescence and p53 activation and comprise a transient cell state governed by a squamous cell phenotype. In our attempt to describe the evolution of these cells we followed up our experiments with a daily sampling of lung tissue after bleomycin induced injury. Our research describes the gene expression profile of Krt8+ ADI cells throughout the development and resolution of fibrosis and identifies a transcriptional convergence of AEC2s and MHCII+ club cells towards the newly described Krt8+ ADI state. Finally we show that lung repair through terminal AEC1 differentiation of Krt8+ ADI cells occurs after injury and is paramount to sustaining epithelial regeneration. Our data indicate that the transcriptional signature of KRT5−/KRT17+ basaloid cells50 in IPF tissues resembles that of Krt8+ ADI described in Publication II. Driven by our findings we propose that chronic lung disease and in particular in IPF may be a result of a dysfunctional molecular differentiation checkpoint that results in a persistent intermediate regenerative cell state that should have otherwise been transient. 17 Publications I and II are the result of a greater attempt to describe the cellular architecture of the respiratory tract in normal health and in disease. These two studies are complementary to each other as they both similarly add to the greater pool of knowledge in the context of aging, injury repair and regeneration. Our research addressed many questions that existed in the field of lung regeneration and injury and highlights novel aspects of aging and IPF. Future research aiming to follow up the context of this thesis includes the study of injury repair and regeneration in the aged lung. Ongoing experiments that have been initiated in our lab will tackle these questions in detail. Administering bleomycin to aged mice will generate a directly comparable dataset that will clarify, to a previously unprecedented level, if and how aging leads to impaired regeneration of the alveolar epithelium, and which cellular processes are involved.

Δημοσίευση Ι: Προκειμένου να μελετήσουμε τις αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία σε επίπεδο κυτταρικού τύπου, χρησιμοποιήσαμε μεταγραφωμική ανάλυση RNA μονοκυττάρων με βάση τη μικρορευστομηχανική σε ομογενοποιημένα δείγματα ολόκληρου του πνεύμονα νεαρών (3 μηνών) και ηλικιωμένων (24 μηνών) ποντικών. Τα δεδομένα αυτά συνδυάστηκαν με δεδομένα πρωτεωμικής και μεταγραφωμικής ανάλυσης μαζικού δείγματος, σε μια προσπάθεια να δημιουργηθεί ένας άτλας του πνεύμονα ηλικιωμένων ποντικών, ο οποίος θα αποτελεί ένα εργαλείο αναφοράς διαθέσιμο στους ερευνητές της βιολογίας του πνεύμονα και της γήρανσης. Εξετάσαμε τα πρότυπα έκφρασης γονιδίων για πάνω από 30 τύπους κυττάρων και εντοπίσαμε αλλαγές που σχετίζονται με τη γήρανση σε όλους τους τύπους κυττάρων. Επιπλέον, δείξαμε ότι η γήρανση συνοδεύεται από αύξηση του μεταγραφικού θορύβου, ένα φαινόμενο που είχε εντοπιστεί πολύ πρόσφατα στον άνθρωπο, υποδηλώνοντας ότι αυτό το χαρακτηριστικό θα μπορούσε στην πραγματικότητα να αποτελεί ένα γενικό χαρακτηριστικό της γήρανσης που πιθανώς επηρεάζει τους περισσότερους τύπους κυττάρων τόσο στους ανθρώπους όσο και στα ποντίκια. Η Δημοσίευση Ι, εκτός από όλα τα ευρήματα που αναφέρονται στα γνωστά χαρακτηριστικά της γήρανσης, επισημαίνει μια μάλλον καινοτόμο αλλοίωση των βλαστικών κυττάρων του κυψελιδικού επιθηλιακού φραγμού που δεν είχε μελετηθεί εκτενώς στο παρελθόν. Οι παρατηρήσεις μας σχετικά με την αυξημένη βιοσύνθεση χοληστερόλης και την υψηλή περιεκτικότητα σε ουδέτερα λιπίδια στα AEC2 γηρασμένων ποντικών ενδέχεται να παραπέμπουν σε προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η λιπιδική σύνθεση του πνευμονικού επιφανειοδραστικού αλλάζει με την ηλικία. Στη μελέτη μας αναφερόμαστε σε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του φαινοτύπου των γηρασμένων AEC2 και εκείνου των ποντικών με νοκ-άουτ Insig1/2 που συσσωρεύουν ουδέτερα λιπίδια, με αποτέλεσμα πνευμονική φλεγμονή που προκαλείται από λιποτοξικότητα. Αυτό υποδηλώνει ότι, σε κάποιο βαθμό, η παρατηρούμενη χρόνια φλεγμονή στους γηρασμένους πνεύμονες θα μπορούσε να επηρεάζεται από την απορρυθμισμένη ομοιόσταση των λιπιδίων. Επιπλέον, άλλα χαρακτηριστικά της γήρανσης, όπως η επιθηλιακή γήρανση, ενδέχεται να συμβάλλουν στον παρατηρούμενο φλεγμονώδη φαινότυπο, καθώς έχει αποδειχθεί ότι η ειδική διαγραφή της τελομεράσης στα AEC2 ποντικών προάγει την ανάπτυξη ενός προφλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος ιστού, με αποτέλεσμα τη μειωμένη ικανότητα επίλυσης οποιασδήποτε οξείας πνευμονικής βλάβης. Τέλος, μέχρι σήμερα οι περισσότερες μελέτες για τη γήρανση των πνευμόνων έχουν επικεντρωθεί κυρίως στη συσσώρευση ινοβλαστών και στην εξασθενημένη λειτουργία του κυψελιδικού επιθηλίου. Μέσω της αμερόληπτης προσέγγισής μας, αποκαλύψαμε αλλαγές στη σύνθεση άλλων αναπνευστικών διαμερισμάτων, ανακαλύπτοντας μια σαφή αλλοίωση των επιθηλιακών κυττάρων των αεραγωγών κατά τη γήρανση, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια συνολική αύξηση του αριθμού των κροσσωτών κυττάρων που ευθυγραμμίζουν τους αεραγωγούς. Δημοσίευση II: Σε αυτή τη μελέτη επιχειρήσαμε να διερευνήσουμε την κινητική της αναγέννησης των πνευμόνων ποντικών σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου χρησιμοποιώντας το μοντέλο βλάβης ποντικών με μπλεομυκίνη. Αναλύσαμε τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση σε 28 τύπους κυττάρων, εστιάζοντας κυρίως στο κυψελιδικό και το επιθήλιο των αεραγωγών. Η εργασία μας περιγράφει πώς τα βλαστοκύτταρα των αεραγωγών και των κυψελίδων αρχικά συγκλίνουν σε μια νέα μεταβατική κατάσταση βλαστοκυττάρων Krt8+, που ονομάζεται Krt8+ κυψελιδικό διαμεσολαβητικό διαφοροποίησης (ADI), πριν ξεκινήσει η κανονική αναγέννηση των AEC1. Εντοπίσαμε αυτά τα Krt8+ ADI κύτταρα σε πολλαπλά μοντέλα πνευμονικής βλάβης ποντικών καθώς και στην ανθρώπινη πνευμονική ίνωση. Τα Krt8+ ADI κύτταρα παρουσιάζουν χαρακτηριστικά της EMT, γήρανσης και ενεργοποίησης του p53 και αποτελούν μια μεταβατική κυτταρική κατάσταση που διέπεται από έναν πλακώδη κυτταρικό φαινότυπο. Στην προσπάθειά μας να περιγράψουμε την εξέλιξη αυτών των κυττάρων, παρακολουθήσαμε τα πειράματά μας με καθημερινή δειγματοληψία πνευμονικού ιστού μετά από βλάβη που προκλήθηκε από μπλεομυκίνη. Η έρευνά μας περιγράφει το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των Krt8+ ADI κυττάρων καθ' όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης και της εξάλειψης της ίνωσης και εντοπίζει μια μεταγραφική σύγκλιση των AEC2 και των MHCII+ club cells προς τη νεοπεριγραφόμενη κατάσταση Krt8+ ADI. Τέλος, δείχνουμε ότι η πνευμονική αποκατάσταση μέσω της τελικής διαφοροποίησης των AEC1 από τα Krt8+ ADI κύτταρα λαμβάνει χώρα μετά τη βλάβη και είναι πρωταρχικής σημασίας για τη διατήρηση της επιθηλιακής αναγέννησης. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η μεταγραφική υπογραφή των KRT5−/KRT17+ βασαλοειδών κυττάρων50 σε ιστούς IPF μοιάζει με εκείνη των Krt8+ ADI που περιγράφεται στη Δημοσίευση II. Με βάση τα ευρήματά μας, προτείνουμε ότι η χρόνια πνευμονική νόσος και ειδικότερα η IPF μπορεί να είναι αποτέλεσμα ενός δυσλειτουργικού μοριακού σημείου ελέγχου διαφοροποίησης που οδηγεί σε μια επίμονη ενδιάμεση αναγεννητική κατάσταση των κυττάρων, η οποία διαφορετικά θα έπρεπε να είναι παροδική. 17 Οι Δημοσιεύσεις I και II είναι το αποτέλεσμα μιας ευρύτερης προσπάθειας να περιγραφεί η κυτταρική αρχιτεκτονική της αναπνευστικής οδού σε φυσιολογικές συνθήκες υγείας και σε περίπτωση νόσου. Αυτές οι δύο μελέτες αλληλοσυμπληρώνονται, καθώς και οι δύο συμβάλλουν παρόμοια στη διεύρυνση της γνώσης στο πλαίσιο της γήρανσης, της αποκατάστασης τραυματισμών και της αναγέννησης. Η έρευνά μας ασχολήθηκε με πολλά ερωτήματα που υπήρχαν στον τομέα της αναγέννησης και της βλάβης των πνευμόνων και επισημαίνει νέες πτυχές της γήρανσης και της IPF. Μελλοντική έρευνα με στόχο την παρακολούθηση του πλαισίου αυτής της διατριβής περιλαμβάνει τη μελέτη της αποκατάστασης βλαβών και της αναγέννησης στους πνεύμονες των ηλικιωμένων. Τρέχοντα πειράματα που έχουν ξεκινήσει στο εργαστήριό μας θα εξετάσουν αυτά τα ερωτήματα λεπτομερώς.