The role of microRNAs in Non-Hodgkin Lymphomas: association with prognosis and response to treatment

Abstract

Large B-cell lymphoma (LBCL) remains a biologically and clinically heterogeneous disease, with a substantial proportion of patients experiencing relapse or refractory disease despite standard immunochemotherapy regimens such as R-CHOP. Prognosis is primarily based on the International Prognostic Index (IPI) and selected biological markers, including cell-of-origin classification (GCB/ABC) and MYC/BCL2 double expression. Nevertheless, there is an ongoing need for novel, non-invasive, and reliable biomarkers. MicroRNAs (miRNAs) are small (~22-nucleotide) regulatory molecules that modulate gene expression at the post-transcriptional level, and circulating miRNAs have been proposed as potential diagnostic and prognostic biomarkers in LBCL. Objective: The aim of this study was to evaluate serum expression levels of miR-155-3p, miR-142-3p, and miR-22-3p at diagnosis and to investigate their associations with clinicopathological parameters and overall survival (OS). Patients and Methods: Serum samples were prospectively collected and analyzed from 45 newly diagnosed LBCL patients (age range 34–84 years; 26 males) treated at our center over a 4.5-year period, and from 26 healthy controls. All patients received immunochemotherapy. RNA isolation was performed using the miRNeasy Serum/Plasma Kit, and cDNA synthesis was performed using the TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Quantitative RT-PCR was conducted on a LightCycler 480 platform using TaqMan™ Advanced miRNA assays for miR-155-3p, miR-142-3p, and miR-22-3p. Exogenous spike-in Ath-miR-159 from Arabidopsis thaliana was used for normalization, and all samples were analyzed in duplicate. The 25th and 75th percentiles of controls were used as cutoffs for low and high expression. Statistical analyses included Mann–Whitney U and χ² tests, Kaplan–Meier survival analysis with log-rank testing, and multivariable Cox proportional hazards modeling for variables with p<0.05 in univariable analysis (SPSS v29). Results: The median patient age was 67 years (58% male), with a median follow-up of 26 months; 13 patients died during the study period. Serum miR-155-3p and miR-142-3p levels did not differ significantly between patients and controls, whereas miR-22-3p was significantly elevated in LBCL patients (p<0.001). Low miR-142 expression was associated with increased MYC expression (p=0.023) and a lower frequency of the non-GCB phenotype (p=0.026), while high miR-22 expression was more common in non-GCB cases (p=0.046). In univariable analysis, B symptoms, serum albumin <3.5 g/dL, IPI score 3–5, hyponatremia, neutropenic fever, high serum miR-155-3p expression, and low serum miR-142-3p expression were associated with inferior OS. Multivariable analysis confirmed high miR-155-3p expression (HR 6.24, p=0.017) and low miR-142-3p expression (HR 7.52, p=0.01) as independent adverse prognostic factors for OS. Conclusions: Elevated serum miR-22-3p levels characterize patients with LBCL but are not associated with overall survival. In contrast, high miR-155-3p expression and low miR-142-3p expression represent independent adverse prognostic factors for OS, highlighting their potential utility as circulating biomarkers for risk stratification. Although preliminary due to the limited sample size, these findings warrant validation in larger, multicenter studies and further exploration of their integration into existing prognostic models.

Το Λέμφωμα από Μεγάλα Β κύτταρα (ΛΜΒΚ) παραμένει μια βιολογικά και κλινικά ετερογενής νόσος με σημαντικό ποσοστό ασθενών να παρουσιάζουν υποτροπή ή ανθεκτικότητα παρά τη χορήγηση τυπικών θεραπευτικών σχημάτων όπως το R-CHOP. Η πρόγνωση βασίζεται κυρίως στον Διεθνή Προγνωστικό Δείκτη (IPI) και σε βιολογικούς δείκτες (GCB/ABC υπότυπος, διπλή έκφραση MYC/BCL2). Ωστόσο, υπάρχει ανάγκη για νέους, μη επεμβατικούς και αξιόπιστους βιοδείκτες. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ρυθμιστικά μόρια ~22 νουκλεοτιδίων που διαμορφώνουν τη γονιδιακή έκφραση σε μεταμεταγραφικό επίπεδο. Τα κυκλοφορούντα miRNAs έχουν προταθεί ως βιοδείκτες για τη διάγνωση και πρόγνωση στο ΛΜΒΚ. Σκοπός της μελέτης: Σκοπός ήταν η αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης των miR-155-3p, miR-142-3p και miR-22-3p στον ορό κατά τη διάγνωση και η συσχέτισή τους με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους και την ολική επιβίωση (OS). Ασθενείς και Μέθοδοι: Συλλέχθηκαν προοπτικά και αναλύθηκαν δείγματα ορού από 45 νεοδιαγνωσμένους ασθενείς με ΛΜΒΚ (εύρος ηλικίας 34–84 έτη, 26 άνδρες) που αντιμετωπίστηκαν στο κέντρο μας επί 4,5 έτη και από 26 υγιείς μάρτυρες. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν ανοσοχημειοθεραπεία. Η απομόνωση RNA έγινε με miRNeasy Serum/Plasma Kit και η σύνθεση cDNA με το TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Η qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε σύστημα LightCycler 480 με TaqMan™ Advanced miRNA assays για τα miR-155-3p (477926_mir), miR-142-3p (477910_mir) και miR-22-3p (477985_mir). Χρησιμοποιήθηκε εξωγενές spike-in Ath-miR-159 από Arabidopsis thaliana για ομαλοποίηση, ενώ κάθε δείγμα αναλύθηκε σε διπλότυπα. Οι 25η/75η εκατοστιαίες θέσεις των μαρτύρων ορίστηκαν ως κατώφλια υπο-/υπερέκφρασης. Οι συγκρίσεις έγιναν με τα τεστ Mann–Whitney U/χ², η OS αναλύθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και το log-rank test. Μεταβλητές με p<0.05 στη μονοπαραγοντική ανάλυση αξιολογήθηκαν περαιτέρω σε πολυπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιώντας το μοντέλο Cox proportional hazards, προκειμένου να εκτιμηθεί η ανεξάρτητη προγνωστική τους αξία (SPSS v29, Chicago, IL). Αποτελέσματα: Η διάμεση ηλικία ήταν τα 67 έτη (58% άνδρες). Η διάμεση διάρκεια παρακολούθησης ήταν 26 μήνες. Συνολικά 13 ασθενείς απεβίωσαν μέχρι το τέλος καταγραφής της μελέτης. Τα επίπεδα των miR-155-3p και miR-142-3p δεν διέφεραν σημαντικά έναντι των μαρτύρων, ενώ το miR-22-3p ήταν αυξημένο στους ασθενείς (p<0.001). Η χαμηλή έκφραση του miR-142 συσχετίστηκε με αυξημένη έκφραση του MYC (p=0.023) και χαμηλότερη συχνότητα του φαινοτύπου non-GCB (p=0.026), ενώ υψηλή έκφραση του miR-22 παρατηρήθηκε συχνότερα στον υποτύπο non-GCB (p=0.046). Στη μονοπαραγοντική ανάλυση, τα Β-συμπτώματα, η αλβουμίνη <3.5 g/dL, το IPI 3–5, η υπονατριαιμία, το ουδετεροπενικό εμπύρετο, η υπερέκφραση miR-155-3p ορού και η υποέκφραση miR-142-3p ορού συσχετίστηκαν με χειρότερη OS. Η πολυπαραγοντική ανάλυση επιβεβαίωσε την υπερέκφραση miR-155-3p (HR: 6.24, p=0.017) και την υποέκφραση miR-142-3p (HR: 7.52, p=0.01) ως ανεξάρτητους δυσμενείς προγνωστικούς δείκτες. Συμπεράσματα: Τα αυξημένα επίπεδα miR-22-3p χαρακτηρίζουν τους ασθενείς με ΔΛΜΒΚ, χωρίς όμως να συσχετίζονται με την OS. Αντίθετα, η υπερέκφραση miR-155-3p και η υποέκφραση miR-142-3p αποτελούν ανεξάρτητους δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες για την OS, αναδεικνύοντας τη δυνητική χρησιμότητά τους ως βιοδείκτες στη διαστρωμάτωση κινδύνου. Τα ευρήματα, αν και προκαταρκτικά λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος, υποστηρίζουν την ανάγκη επιβεβαίωσης σε μεγαλύτερες πολυκεντρικές μελέτες και τη διερεύνηση της ενσωμάτωσής τους σε υφιστάμενα προγνωστικά συστήματα.