Ιστοειδική ανάλυση του βιολογικού ρόλου των DNA απομεθυλασών ΤΕΤ2 και ΤΕΤ3 σε Τ-λεμφοκύτταρα

Abstract

The Ten-Eleven Translocation (TET) protein family comprises three members TET1, TET2, and TET3, and functions as a key regulator of active DNA demethylation through the stepwise oxidation of 5-methylcytosine (5mC) into 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and ultimately 5-carboxylcytosine (5caC). TET2 and TET3 are expressed at higher levels in T cells and play an important role in the differentiation of invariant Natural Killer T (iNKT) cells. iNKT cells develop in the thymus with a pre-activated phenotype and are classified into three major subsets with distinct functional properties: NKT1, which represent the majority, and the rarer NKT2 and NKT17 subsets. In the present thesis, we investigate the role of TET proteins in controlling T cell proliferation and preventing hematological malignancies, as well as their contribution to the activation and functional specialization of iNKT cells in the periphery. For this purpose, control mice and genetically modified mice models lacking Tet2 (Tet2 knock-out, KO), Tet3 (Tet3 KO), or both (Tet2/3 double knock-out, DKO) were used. Cells from the thymus, spleen, liver, and lungs were isolated and analyzed by flow cytometry and quantitative real-time PCR (RT-qPCR). We demonstrate that the simultaneous loss of TET2 and TET3 leads to the gradual acquisition of malignant features, including increased expression of the proto-oncogene Myc in CD4⁺ T cells. Despite these alterations, our data show that CD4⁺ T cells in both control and Tet2/3 DKO mice maintain a highly diverse T cell receptor repertoire and remain polyclonal in the thymus and spleen. We further show that in peripheral organs of mice deficient for Tet2 and Tet3, the NKT17 subset is increased, along with enhanced IL-17 production following in vitro stimulation, whereas a statistically significant reduction in co-production of IL-4 and IFN-γ is observed. In addition, we investigate the role of individual loss of TET3 and TET2 in peripheral iNKT cell activation and acquisition of effector functions. We find that TET3 regulates in vivo iNKT cell activation upon antigen exposure, as well as their differentiation into effector cells. In contrast, TET2 deficiency results in milder phenotypic changes in peripheral tissues. Overall, the findings of this thesis highlight the critical role of TET2 and TET3 in maintaining controlled T cell proliferation and preventing malignant transformation, providing new insights into the epigenetic mechanisms underlying hematological malignancies. Furthermore, they elucidate the contribution of TET proteins to the regulation of iNKT cell activation and functional specialization in the periphery, with potential implications for the development of targeted immunotherapeutic strategies.

Η οικογένεια των πρωτεϊνών με μετατόπιση δέκα έντεκα (Ten-Eleven Translocation (TET)) περιλαμβάνει τα μέλη TET1, TET2 και TET3 και λειτουργεί ως βασικός ρυθμιστής της ενεργού απομεθυλίωσης του DNA μέσω της διαδοχικής οξείδωσης της 5-μεθυλοκυτοσίνης (5mC) σε 5-υδροξυμεθυλοκυτοσίνη (5hmC), 5-φορμυλοκυτοσίνη (5fC) και τελικά σε 5-καρβοξυκυτοσίνη (5caC). Οι ΤΕΤ2 και ΤΕΤ3 εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα στα Τ κύτταρα και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των αμετάβλητων Τ κυττάρων φυσικών φονέων (invariant Natural Killer T cells, iNKTs). Τα iNKT αναπτύσσονται στον θύμο έχοντας ήδη ενεργοποιημένο φαινότυπο και διακρίνονται σε τρεις κύριους υποπληθυσμούς με διακριτά λειτουργικά χαρακτηριστικά, τα ΝΚΤ1 που αποτελούν την πλειοψηφία, τα ΝΚΤ2 και τα ΝΚΤ17 που είναι τα πιο σπάνια. Στην παρούσα διατριβή διερευνάται ο ρόλος των TET πρωτεϊνών στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων και στην πρόληψη αιματολογικών νεοπλασιών, καθώς και η συμβολή τους στην ενεργοποίηση και λειτουργική εξειδίκευση των iNKT κυττάρων στην περιφέρεια. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ποντικοί ελέγχου και γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικών με έλλειψη του Tet2 (Tet2 knock-out, KO), του Tet3 (Tet3 KO) ή και των δύο (Tet2/3 double knock-out, DKO). Η ανάλυση κυττάρων από θύμο, σπλήνα, ήπαρ και πνεύμονες πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR). Στην παρούσα διατριβή αποδεικνύουμε ότι η ταυτόχρονη απώλεια των ΤΕΤ2 και ΤΕΤ3 οδηγεί σε σταδιακή απόκτηση κακοηθών χαρακτηριστικών, όπως στην αυξημένη έκφραση του πρωτο-ογκογονιδίου Myc στα CD4+ Τ κύτταρα . Παρά τις αλλαγές αυτές, τα δεδομένα μας δείχνουν πως τα CD4⁺ Τ κύτταρα τόσο στους ποντικούς ελέγχου όσο και στους Tet2/3 DKO ποντικούς διατηρούν υψηλή ποικιλία του υποδοχέα των Τ κυττάρων και παραμένουν πολυκλωνικά στον θύμο και στον σπλήνα.Αποδείξαμε επίσης πως σε περιφερικά όργανα ποντικών ελλειμματικών ως προς τα γονίδια Tet2 και Tet3 αυξάνεται ο ΝΚΤ17 υποπληθυσμός, καθώς και η IL-17 έπειτα από in vitro ενεργοποίηση, ενώ παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική μείωση στην συμπαραγωγή IL-4 και IFNγ. Ακόμη, σε αυτή τη μελέτη διερευνούμε τον ρόλο της απώλειας της ΤΕΤ3 και της ΤΕΤ2 στην επακόλουθη περιφερική ενεργοποίηση των iNKT κυττάρων και στην απόκτηση ιδιοτήτων δραστικών κυττάρων. Διαπιστώνουμε ότι η ΤΕΤ3 ρυθμίζει την ενεργοποίηση των iNKT κυττάρων in vivo μετά από επαφή με το αντιγόνο, καθώς και της διαφοροποίησής τους σε δραστικά κύτταρα. Η απώλεια της ΤΕΤ2 οδηγεί σε πιο ήπιους φαινοτύπους στους περιφερικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα της διατριβής αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των ΤΕΤ2 και ΤΕΤ3 στη διατήρηση του ελεγχόμενου πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων και στην πρόληψη της κακοήθους τους εξαλλαγής, παρέχοντας νέα γνώση για τους επιγενετικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στις αιματολογικές νεοπλασίες. Παράλληλα, αποσαφηνίζεται η συμβολή των ΤΕΤ πρωτεϊνών στη ρύθμιση της ενεργοποίησης και της λειτουργικής εξειδίκευσης των iNKT κυττάρων στην περιφέρεια, με δυνητικές προεκτάσεις για τον σχεδιασμό στοχευμένων ανοσοθεραπευτικών προσεγγίσεων.