Διερεύνηση της διασποράς και των μηχανισμών αντιμικροβιακής αντοχής στην κολιστίνη στελεχών Acinetobacter baumannii

Abstract

Acinetobacter baumannii is a frequent cause of nosocomial infections and is classified by the World Health Organization as a high-priority pathogen. It is commonly isolated in Intensive Care Units (ICUs), where extensive antimicrobial resistance significantly complicates therapeutic management. Extensively drug-resistant (XDR) and pandrug-resistant (PDR) strains severely limit available treatment options. Colistin remains a last-resort therapeutic agent; however, the emergence of resistance has been associated with prolonged hospitalization and increased mortality rates. A high prevalence of resistant strains has been reported in endemic regions such as Greece and is linked to mechanisms that have not yet been fully elucidated at the local level. The aim of this study was the phenotypic, molecular, and epidemiological characterization of colistin-resistant A. baumannii clinical isolates, with emphasis on resistance mechanisms, virulence-associated traits, and clonal relatedness. In parallel, the activity of lytic bacteriophages derived from hospital wastewater against these isolates was investigated. A total of 40 clinical A. baumannii isolates were included in the study, obtained from hospitalized patients in two tertiary-care public hospitals in Thessaloniki, Greece: “Hippokration” General Hospital and “G. Papanikolaou” General Hospital, during the period January–June 2022. Identification was performed using the VITEK 2 system and conventional microbiological methods. Antimicrobial susceptibility profiling was conducted using VITEK 2. Colistin susceptibility was evaluated using a combination of methods, including VITEK 2, Etest, and broth microdilution as the reference method. Phenotypic virulence traits were assessed through biofilm formation, hemolysis, and motility assays. Clonal relatedness was investigated using Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Multilocus Sequence Typing (MLST). Resistance mechanisms were studied through MIC determination in the presence and absence of carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), PCR detection of mcr-1 to mcr-9 genes, sequencing of lpx and pmr genes, and analysis of efflux pump gene expression, focusing on the EmrAB system. Additionally, the presence of bacteriophages was investigated in five hospital wastewater samples.Of the 40 isolates, 67.5% originated from Hippokration General Hospital and 32.5% from G. Papanikolaou General Hospital. ICUs represented the primary source of isolation (47.5%), while blood cultures were the most frequent specimen type (40.0%). Species-level identification accuracy exceeded 95%. Overall, 95.0% of isolates were classified as pandrug-resistant and 5.0% as extensively drug-resistant. All isolates (100.0%) were resistant to colistin, with MIC values ranging from 4 to 32 μg/mL, MIC50 of 8 μg/mL, and MIC90 of 16 μg/mL. Biofilm formation was observed in all isolates, with strong formation in 67.5%, moderate in 22.5%, and weak in 10.0%. All isolates (100.0%) exhibited α-hemolytic activity. Twitching motility displayed heterogeneity, with 25.0% non-motile, 55.0% moderately motile, and 20.0% highly motile isolates. Surface-associated motility was positive in all isolates (100.0%). The presence of CCCP resulted in at least a 16-fold reduction in colistin MIC across all isolates. PFGE analysis revealed 38 distinct pulsotypes and five major clonal groups, while 35.0% of isolates exhibited unique pulsotypes. Group A included three isolates and was detected only in Hippokration General Hospital, whereas groups B, C, D, and E (7, 9, 3, and 4 isolates, respectively) were identified in both hospitals. MLST analysis was performed on a representative subset of 10 isolates selected based on PFGE distribution, revealing that 80.0% belonged to sequence type ST2, 10.0% to ST115, and 10.0% to ST1, with 90.0% overall classified within the international clone IC2.Molecular analysis demonstrated the presence of bap, csuE, basD, and pld genes in 77.5%, 87.5%, 100.0%, and 95.0% of isolates, respectively, while bauA and omp33-36 were detected in 17.5% and 20.0%. The ompA and pglC genes were not detected. None of the mcr-1 to mcr-9 genes were identified. No non-synonymous mutations were observed in lpxA and pmrA. In contrast, the N287D substitution in lpxC was detected in 90.0% of isolates, E117K in lpxD in 75.0%, A226V in pmrB in 65.0%, and N284D in pmrC in 100.0%. A six-nucleotide insertion in pmrB, resulting in the addition of two amino acids, was identified in one isolate. The emrA and emrB genes, encoding components of the EmrAB efflux pump system, exhibited coordinated and inducible expression under colistin exposure, while reduced expression in the presence of CCCP supports the involvement of proton motive force (PMF)-dependent mechanisms. However, the observed heterogeneity among isolates suggests that efflux pumps are not the sole mechanism contributing to resistance.Regarding the detection of lytic bacteriophages from hospital wastewater, no phages with activity against the studied isolates were identified.

Το Acinetobacter baumannii είναι συχνό αίτιο νοσοκομειακών λοιμώξεων και κατατάσσεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας στα παθογόνα υψηλής προτεραιότητας, με αυξημένη συχνότητα απομόνωσης σε Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ), όπου η εκτεταμένη αντοχή στα αντιβιοτικά δυσχεραίνει τη θεραπευτική αντιμετώπιση. Στελέχη εκτεταμένης ή πλήρους αντοχής περιορίζουν σημαντικά τις διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές. Η κολιστίνη αποτελεί θεραπεία τελευταίας γραμμής. Η εμφάνιση αντοχής σχετίζεται με παρατεταμένη νοσηλεία και υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Αυξημένη συχνότητα ανθεκτικών στελεχών καταγράφεται σε ενδημικές περιοχές, όπως η Ελλάδα και συνδέεται με μηχανισμούς που δεν έχουν πλήρως αποσαφηνιστεί σε τοπικό επίπεδο. Στόχος της μελέτης είναι ο φαινοτυπικός, μοριακός και επιδημιολογικός χαρακτηρισμός κλινικών στελεχών A. baumannii ανθεκτικών στην κολιστίνη, με έμφαση στους μηχανισμούς αντοχής, στα χαρακτηριστικά λοιμογονικότητας και στην κλωνική συγγένεια. Παράλληλα, διερευνήθηκε η δράση λυτικών βακτηριοφάγων από νοσοκομειακά λύματα έναντι των στελεχών αυτών. Στη μελέτη συμπεριελήφθησαν 40 κλινικά στελέχη A. baumannii που απομονώθηκαν από νοσηλευόμενους ασθενείς σε δύο δημόσια νοσοκομεία τριτοβάθμιας περίθαλψης της Θεσσαλονίκης, το Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης «Ιπποκράτειο» και το Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης «Γ. Παπανικολάου», κατά την περίοδο Ιανουαρίου-Ιουνίου 2022. Η ταυτοποίηση πραγματοποιήθηκε με το σύστημα VITEK 2 και με συμβατικές μικροβιολογικές μεθόδους. Ο καθορισμός του συνολικού φαινοτυπικού προφίλ αντοχής βασίστηκε στο σύστημα VITEK 2. Για την κολιστίνη, η ευαισθησία αξιολογήθηκε με συνδυασμό μεθόδων: VITEK 2, Etest και τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ζωμό ως μέθοδο αναφοράς. Οι φαινοτυπικές ιδιότητες λοιμογονικότητας εκτιμήθηκαν με δοκιμές σχηματισμού βιοϋμενίου, αιμόλυσης και κινητικότητας. Η κλωνική συγγένεια διερευνήθηκε με Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) και με Multilocus Sequence Typing (MLST). Οι μηχανισμοί αντοχής μελετήθηκαν με προσδιορισμό MIC παρουσία και απουσία CCCP, με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για τα γονίδια mcr-1 έως mcr-9, καθώς και με αλληλούχηση των γονιδίων lpx και pmr και με ανάλυση γονιδιακής έκφρασης αντλιών εκροής. Διερευνήθηκε επίσης η παρουσία βακτηριοφάγων σε πέντε δείγματα νοσοκομειακών λυμάτων.Από τα 40 στελέχη, το 67,5% προήλθε από το Γ.Ν.Θ. «Ιπποκράτειο» και το 32,5% από το Γ.Ν.Θ «Γ. Παπανικολάου». Η ΜΕΘ αποτέλεσε την κύρια μονάδα απομόνωσης (47,5%), ενώ οι αιμοκαλλιέργειες αποτέλεσαν τη συχνότερη πηγή απομόνωσης (40,0%). Η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους υπερέβαινε το 95%. Συνολικά, 95,0% των στελεχών ήταν πανανθεκτικά και 5,0% εκτεταμένα ανθεκτικά. Όλα τα στελέχη (100,0%) εμφάνισαν αντοχή στην κολιστίνη, με τιμές MIC 4-32 μg/mL, MIC50 8 μg/mL και MIC90 16 μg/mL. Η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου ήταν καθολική, με ισχυρό σχηματισμό στο 67,5%, μέτριο στο 22,5% και ασθενή στο 10,0%. Όλα τα στελέχη (100,0%) εμφάνισαν αιμολυτική δραστηριότητα τύπου α. Η κινητικότητα τύπου συσπάσεων εμφάνισε ετερογένεια. Το 25,0% των στελεχών ήταν μη κινητικά, το 55,0% μέτρια κινητικά και το 20,0% έντονα κινητικά. Η διάχυτη επιφανειακή κινητικότητα ήταν θετική σε όλα τα στελέχη (100,0%). Η παρουσία του CCCP μείωσε την MIC της κολιστίνης σε όλα τα στελέχη κατά τουλάχιστον 16 φορές. Η PFGE ανέδειξε 38 διακριτούς τύπους παλμών και πέντε κύριες κλωνικές ομάδες, ενώ το 35,0% των στελεχών είχε μοναδικό τύπο παλμών. Η ομάδα A περιλάμβανε 3 στελέχη και ανιχνεύθηκε μόνο στο Γ.Ν.Θ «Ιπποκράτειο», ενώ οι ομάδες B, C, D και E, με 7, 9, 3 και 4 στελέχη αντίστοιχα, εμφανίσθηκαν και στα δύο νοσοκομεία. Η MLST πραγματοποιήθηκε σε αντιπροσωπευτικό υποσύνολο 10 στελεχών, επιλεγμένων βάσει της κατανομής της PFGE, και έδειξε ότι 80,0% των στελεχών ανήκε στον τύπο αλληλουχίας ST2, 10,0% στον ST115 και 10,0% στον ST1, με συνολικά 90,0% να ανήκουν στον διεθνή κλώνο IC2.Ο μοριακός έλεγχος έδειξε παρουσία των γονιδίων bap, csuE, basD και pld σε ποσοστό 77,5%, 87,5%, 100,0% και 95,0% αντίστοιχα, ενώ τα bauA και omp33-36 ανιχνεύθηκαν αντίστοιχα σε 17,5% και 20,0% των στελεχών. Τα γονίδια ompA και pglC δεν ανιχνεύθηκαν. Τα γονίδια mcr-1 έως mcr-9 δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα στέλεχος. Στα γονίδια lpx και pmr δεν καταγράφηκαν μη συνώνυμες μεταλλάξεις στα lpxA και pmrA. Αντίθετα, η αλλαγή N287D στο lpxC ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 90,0%, η E117K στο lpxD σε 75,0%, η A226V στο pmrB σε 65,0%, ενώ στο pmrC η N284D ανιχνεύθηκε σε 100,0%. Σε ένα στέλεχος καταγράφηκε ένθεση έξι νουκλεοτιδίων στο pmrB με προσθήκη δύο αμινοξέων. Τα γονίδια emrA και emrB που κωδικοποιούν για το σύστημα αντλιών ΕmrAB, παρουσίασαν συγχρονισμένη και επαγώγιμη έκφραση υπό πίεση κολιστίνης, ενώ η μείωση της έκφρασης παρουσία CCCP υποστηρίζει την εμπλοκή PMF-εξαρτώμενων μηχανισμών. Ωστόσο, η παρατηρούμενη ετερογένεια μεταξύ των στελεχών υποδηλώνει ότι οι αντλίες εκροής δεν αποτελούν τον μοναδικό μηχανισμό αντοχής. Αναφορικά με τον εντοπισμό λυτικών βακτηριοφάγων με προέλευση από νοσοκομειακά λύματα και δράση έναντι των εξεταζόμενων στελεχών δεν κατέστη δυνατή η ανίχνευση κάποιου ειδικού ως προς τα υπό μελέτη στελέχη.