Study of the impact of dyslipidemias on rheumatoid arthritis and immunometabolism using mouse models

Abstract

Cardiovascular Diseases (CVD) remain the leading cause of mortality worldwide and are inextricably linked to conditions of chronic, low-grade inflammation and dyslipidemia. In patients suffering from autoimmune inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis (RA), the risk of developing CVD is significantly elevated, indicating the existence of common pathophysiological mechanisms between chronic inflammation and atherosclerosis. Serum cholesterol, triglycerides, and triglyceride-rich lipoproteins (TRLs) play an active role in the pathogenesis of such diseases by activating pro-inflammatory pathways. A crucial regulator of cholesterol metabolism is apolipoprotein E (ApoE), while for TRLs it is apolipoprotein C-III (ApoC-III). Furthermore, the qualitative dysfunction of high-density lipoproteins (HDL), independent of HDL cholesterol concentration, has been recognized as a critical factor in immune dysregulation. Under conditions of chronic inflammation, HDL loses its antioxidant and anti-inflammatory properties, partly through a decrease in paraoxonase-1 (PON-1) activity and alterations in the content of apolipoprotein A-I (ApoA-I).In the first part of the present thesis, it was investigated whether combined dyslipidemia induced by the overexpression of ApoC-III affects the pathogenesis of RA, along with the effect of hypolipidemic treatment using fenofibrate. High serum levels of ApoC-III are associated with the inhibition of lipoprotein lipase (LPL) and delayed hepatic clearance of TRLs, resulting in increased serum triglycerides. Additionally, recent data suggest a direct role for ApoC-III in the activation of inflammatory pathways in monocytes and macrophages, cells that are involved in both atherosclerosis and RA. To achieve the objectives of the study, the experimental model of antigen-induced arthritis (AIA) in transgenic APOC3 mice (known as ApoC-III Tg) was utilized. This mouse line overexpresses human ApoC-III protein and exhibits a combined dyslipidemia phenotype (severe hypertriglyceridemia, high total cholesterol, reduced HDL levels). In our experiments, ApoC-III Tg mice developed significantly more severe joint swelling following AIA induction compared to control mice, which was observed macroscopically by measuring knee swelling, as well as by histological analysis of the joints that confirmed the clinical picture. Analyzing the serum of the experimental animals after the completion of the protocol, it was confirmed that the arthritic ApoC-III Tg mice maintained their dyslipidemic profile (high levels of triglycerides and total cholesterol, with concurrently reduced HDL cholesterol levels). Further analysis of the lipoprotein fractions showed reduced levels of ApoA-I, the main protein of HDL. Conversely, human ApoC-III was detected in all fractions, with a significant concentration in VLDL and LDL, similarly to healthy –without AIA– ApoC-III Tg mice, indicating that the inflammatory state is accompanied by significant quantitative and qualitative alterations in the lipoprotein profile. In order to evaluate the functional consequences of these alterations, the antioxidant capacity of the isolated HDL was examined. HDL from arthritic ApoC-III Tg mice exhibited significantly reduced enzymatic activity of PON-1 and a reduced capacity to inhibit LDL oxidation, compared to the control group.These results suggest an overall dysfunction of the HDL particles under hypertriglyceridemic conditions. Furthermore, the direct impact of the dysfunctional HDL on macrophages was investigated through ex vivo incubations. Mitochondrial respiration analyses using the Seahorse system (Agilent) revealed a decrease in the oxygen consumption rate (OCR), maximal respiratory capacity, and coupling efficiency in primary macrophages exposed to HDL from transgenic mice. At the gene expression level in RAW 264.7 macrophages, the same HDL led to a significant increase in the expression of pro-inflammatory markers, such as iNOS, IL-1β, and TNF-α, confirming its role in promoting a pro-inflammatory (M1) phenotype. Subsequently, aiming to treat hypertriglyceridemia, fenofibrate (100 mg/kg/day, i.p. for 7 days) was systematically administered to the ApoC-III Tg mice following the onset of arthritis. The treatment led to the regression of knee swelling and the protection of the joint architecture, as shown histologically. The improvement in the clinical picture was accompanied by a drastic reduction in serum triglyceride and total cholesterol levels. Concurrently, fenofibrate restored HDL functionality by increasing PON-1 activity, improving its antioxidant capacity, and partially reversing structural changes by increasing ApoA-I levels. Although the effect of the improved HDL on the pro-inflammatory gene expression levels of macrophages was marginal, the overall improvement of dyslipidemia demonstrated the critical role of lipids in disease exacerbation. In conclusion, this research confirms that hypertriglyceridemia driven from ApoC-III overexpression promotes inflammation in autoimmune diseases. Dyslipidemia leads to the loss of HDL's protective role, transforming it into a particle that promotes metabolic dysregulation and the inflammatory action of macrophages, thereby exacerbating the clinical picture of RA. Therapeutic targeting of triglycerides through agents such as fenofibrate can reverse these pathological changes, highlighting the importance of an approach that targets dyslipidemia to limit inflammation. In the second part of the present thesis, the impact of a hypercholesterolemic background on the development and severity of RA was investigated, along with the evaluation of the effects of hypolipidemic treatment with simvastatin. Hypercholesterolemia, and dyslipidemia in general, are conditions closely linked to inflammation. Cholesterol accumulation in innate immune cells, including macrophages, promotes their activation and a shift towards pro-inflammatory phenotypes. To achieve the thesis’ objectives, the genetically modified ApoE knockout (ApoE KO) mouse model was used, and arthritis was induced via the AIA protocol. Our analyses showed that ApoE KO mice exhibited a more severe course of arthritis with greater knee swelling from the early stages of the disease, compared to control B6 mice, which was confirmed by the histological analysis of the joints. At the biochemical level, the mice maintained high levels of total cholesterol and significantly reduced levels of HDL cholesterol, with a concurrent decrease in PON-1 activity. Furthermore, the analysis of ApoA-I distribution in the lipoprotein fractions revealed a localization discrepancy. Its presence in low-density fractions indicates a significant reorganization and qualitative alteration of the HDL particles.Phenotypic analysis of splenic macrophages from ApoE KO mice revealed alterations in surface markers compared to the control group. At the peak of arthritis, enhanced expression of the costimulatory molecule CD86 and the antigen-presenting molecule MHC-II was observed, while at the final stage, ApoE KO macrophages presented increased expression of CD163 and CD86, which are also associated with immune activation. These data support that hypercholesterolemia leads to macrophage reprogramming by enhancing their pro-inflammatory function. The administration of simvastatin (20 mg/kg/day, i.p. for 7 days) to the ApoE KO mice improved the lipid profile, significantly restored HDL’s PON-1 functionality, and reduced the severity of arthritis. Additionally, the phenotypic profile of macrophages from the same mice showed a reduction in characteristics associated with increased immune activation. These findings highlight that hypolipidemic treatment not only affects the metabolic aspect of the disease but also directly impacts immunological processes. In conclusion, the current research demonstrates that hypercholesterolemia influences the inflammatory response in RA through the remodeling of macrophage function and the qualitative composition of lipoproteins. Understanding the interaction between lipid metabolism and innate immunity may open new therapeutic avenues that simultaneously target inflammation and metabolic dysfunction by improving dyslipidemia, with the aim of better prognosis not only for arthritis but also for its closely related cardiovascular complications.Overall, this thesis investigates the critical crosstalk between lipid metabolism and inflammation in the pathogenesis of RA utilizing two distinct dyslipidemic mouse models, the ApoC-III Tg and the ApoE KO. Our research demonstrates that both hypertriglyceridemia and hypercholesterolemia significantly exacerbate joint inflammation and structural damage. Despite the model differences, a shared underlying mechanism was identified suggesting that, under dyslipidemic conditions, HDL undergoes structural and functional impairment, characterized by diminished PON-1 antioxidant activity and altered apolipoprotein composition. This qualitative loss of HDL’s protective properties drives the reprogramming of macrophages toward a pro-inflammatory phenotype. Crucially, targeted hypolipidemic interventions not only reversed the lipid imbalances but also restored HDL functionality, reduced macrophage activation, and successfully ameliorated the clinical and histological severity of RA. This work highlights that therapeutic strategies targeting lipid profiles offer dual metabolic and immunological benefits, providing a promising approach to mitigating both arthritis severity and its associated cardiovascular risks in clinical practice.

Η Καρδιαγγειακή Νόσος (ΚΑΝ) παραμένει η κορυφαία αιτία θνησιμότητας παγκοσμίως και είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με καταστάσεις χρόνιας, χαμηλής έντασης φλεγμονή και δυσλιπιδαιμία. Σε ασθενείς που πάσχουν από αυτοάνοσα φλεγμονώδη νοσήματα, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ), ο κίνδυνος εμφάνισης ΚΑΝ είναι σημαντικά αυξημένος, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη κοινών παθοφυσιολογικών μηχανισμών μεταξύ χρόνιας φλεγμονής και αθηροσκλήρωσης. Η χοληστερολή, τα τριγλυκερίδια και οι πλούσιες σε αυτά λιποπρωτεΐνες (TRLs) του ορού διαδραματίζουν ενεργό ρόλο στην παθογένεση τέτοιων νόσων, ενεργοποιώντας προφλεγμονώδη μονοπάτια. Σημαντικός ρυθμιστής του μεταβολισμού της χοληστερόλης είναι η απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoE) ενώ των TRLs είναι η απολιποπρωτεΐνη C-III (ApoC-III). Επιπλέον, η ποιοτική δυσλειτουργία των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL), ανεξάρτητα από την συγκέντρωση της HDL-χοληστερόλης, έχει αναγνωριστεί ως κρίσιμος παράγοντας ανοσολογικής απορρύθμισης. Σε συνθήκες χρόνιας φλεγμονής, η HDL χάνει τις αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές της, μεταξύ άλλων μέσω μείωσης της δραστηριότητας της παραοξονάσης-1 (PON-1) και μεταβολών στη σύσταση της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι (ApoA-I). Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε κατά πόσο η συνδυαστική δυσλιπιδαιμία προκαλούμενη από την υπερέκφραση της ApoC-III, επιδρά στην παθογένεση της ΡΑ καθώς και η επίδραση υπολιπιδαιμικής θεραπείας με χρήση φενοφιμπράτης. Τα υψηλά επίπεδα της ApoC-III στον ορό σχετίζονται με αναστολή της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LPL) και καθυστέρηση της ηπατικής κάθαρσης των TRLs με αποτέλεσμα την αύξηση των τριγλυκεριδίων στον ορό. Επιπροσθέτως, νεότερα δεδομένα υποδεικνύουν έναν άμεσο ρόλο της ApoC-III στην ενεργοποίηση φλεγμονωδών μονοπατιών σε μονοκύτταρα και μακροφάγα, κύτταρα που εμπλέκονται τόσο στην αθηροσκλήρωση όσο και στη ΡΑ.Για την επίτευξη των στόχων της μελέτης, χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό μοντέλου της αντιγονο-επαγόμενης αρθρίτιδας (AIA) σε διαγονιδιακούς ποντικούς APOC3 (γνωστούς ως ApoC-III Tg). Αυτή η σειρά ποντικών υπερεκφράζει την ανθρώπινη πρωτεΐνη ApoC-III και εμφανίζει φαινότυπο συνδυαστικής δυσλιπιδαιμίας (υπερτριγλυκεριδαιμία, υψηλή ολική χοληστερόλη, μειωμένη HDL). Στα πειράματά μας, οι ApoC-III Tg ποντικοί, έπειτα από την επαγωγή της ΑΙΑ, ανέπτυξαν σημαντικά εντονότερο οίδημα στην άρθρωση, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, που παρατηρήθηκε μακροσκοπικά με μέτρηση του οιδήματος στο γόνατο αλλά και με ιστολογική ανάλυση των αρθρώσεων που επιβεβαίωσε την κλινική εικόνα. Αναλύοντας τον ορό των πειραματόζωων μετά το πέρας του πρωτοκόλλου, επιβεβαιώθηκε ότι οι αρθριτικοί ApoC-III Tg ποντικοί διατήρησαν το δυσλιπιδαιμικό τους προφίλ (υψηλά επίπεδα τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης, με ταυτόχρονα μειωμένα επίπεδα HDL χοληστερόλης). Περαιτέρω ανάλυση των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων έδειξε μειωμένα επίπεδα της ApoA-I, της κύριας πρωτεΐνης της HDL. Αντιθέτως, η ανθρώπινη ApoC-III ανιχνεύθηκε σε όλα τα κλάσματα, με σημαντική συγκέντρωση στις VLDL και LDL, παρόμοια με τους υγιής –χωρίς AIA– ApoC-III Tg ποντικούς, υποδεικνύοντας ότι η φλεγμονώδης κατάσταση συνοδεύεται από σημαντικές ποσοτικές και ποιοτικές μεταβολές στο προφίλ των λιποπρωτεϊνών. Προκειμένου να αξιολογηθούν οι λειτουργικές συνέπειες αυτών των μεταβολών, εξετάστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα της απομονωμένης HDL. Η HDL από αρθριτικούς ApoC-III Tg ποντικούς παρουσίασε σημαντικά μειωμένη ενζυμική δραστικότητα της PON-1 και μειωμένη ικανότητα αναστολής της οξείδωσης της LDL, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια συνολική δυσλειτουργία των σωματιδίων της HDL σε συνθήκες υπερτριγλυκεριδαιμίας. Επιπλέον, διερευνήθηκε η άμεση επίδραση της δυσλειτουργικής HDL στα μακροφάγα, μέσω ex vivo επωάσεων. Αναλύσεις της μιτοχονδριακής αναπνοής με το σύστημα Seahorse (Agilent) αποκάλυψαν μείωση του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (OCR), της μέγιστης αναπνευστικής ικανότητας και της αποτελεσματικότητας σύζευξης (coupling efficiency) σε primary μακροφάγα που εκτέθηκαν σε HDL από διαγονιδιακούς ποντικούς. Σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης σε RAW 264.7 μακροφάγα, η ίδια HDL οδήγησε σε σημαντική αύξηση της έκφρασης προφλεγμονωδών δεικτών, όπως τα iNOS, IL-1β και TNF-α, επιβεβαιώνοντας τον ρόλο της στην προαγωγή ενός προφλεγμονώδους (Μ1) φαινότυπου. Στη συνέχεια, στοχεύοντας στην αντιμετώπιση της υπερτριγλυκεριδαιμίας, χορηγήθηκε συστηματικά φενοφιμπράτη (100 mg/kg/ημέρα, i.p. για 7 ημέρες) στους ApoC-III Tg ποντικούς μετά την έναρξη της αρθρίτιδας. Η θεραπεία οδήγησε σε υποχώρηση του οιδήματος του γονάτου και στην προστασία της αρχιτεκτονικής της άρθρωσης, όπως φάνηκε ιστολογικά. Η βελτίωση της κλινικής εικόνας συνοδεύτηκε από δραστική μείωση των επιπέδων τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης στον ορό. Ταυτόχρονα, η φενοφιμπράτη αποκατέστησε τη λειτουργικότητα της HDL, αυξάνοντας τη δραστικότητα της PON-1, βελτιώνοντας την αντιοξειδωτική της ικανότητα και αναστρέφοντας εν μέρει τις δομικές αλλαγές, αυξάνοντας τα επίπεδα της ApoA-I. Αν και η επίδραση της βελτιωμένης HDL στα επίπεδα προφλεγμονωδών γονιδίων των μακροφάγων ήταν οριακή, η συνολική βελτίωση της δυσλιπιδαιμίας απέδειξε τον κρίσιμο ρόλο των λιπιδίων στην επιδείνωση της νόσου. Συμπερασματικά, η έρευνα αυτή επιβεβαιώνει ότι η υπερτριγλυκεριδαιμία προερχόμενη από την υπερέκφραση της ApoC-III, επάγει την φλεγμονή στα αυτοάνοσα νοσήματα. Η δυσλιπιδαιμία οδηγεί σε απώλεια του προστατευτικού ρόλου της HDL, μετατρέποντάς την σε ένα σωματίδιο που προάγει τη μεταβολική απορρύθμιση και τη φλεγμονώδη δράση των μακροφάγων, επιδεινώνοντας την κλινική εικόνα της ΡΑ. Η θεραπευτική στόχευση των τριγλυκεριδίων, μέσω παραγόντων όπως η φενοφιμπράτη, μπορεί να αναστρέψει αυτές τις παθολογικές αλλαγές, αναδεικνύοντας τη σημασία μιας προσέγγισης που στοχεύει τη δυσλιπιδαιμία στον περιορισμό της φλεγμονής. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, διερευνήθηκε η επίδραση του υπερχοληστερολαιμικού υποβάθρου στην ανάπτυξη και βαρύτητα της ΡΑ καθώς και η αξιολόγηση των επιδράσεων της υπολιπιδαιμικής θεραπείας με σιμβαστατίνη. Η υπερχοληστερολαιμία, και η δυσλιπιδαιμία γενικότερα, αποτελούν καταστάσεις στενά συνδεδεμένες με τη φλεγμονή. Η συσσώρευση χοληστερόλης στα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, προάγει την ενεργοποίησή τους και τη στροφή προς προφλεγμονώδεις φαινοτύπους. Για την επίτευξη των στόχων της μελέτης, χρησιμοποιήθηκε το γενετικά τροποποιημένο μοντέλο ποντικών ApoE knockout (ApoE KO) και η αρθρίτιδα επήχθη μέσω του πρωτοκόλλου της AIA. Οι αναλύσεις μας έδειξαν ότι οι ApoE KO ποντικοί εμφάνισαν βαρύτερη πορεία αρθρίτιδας με μεγαλύτερη διόγκωση του γόνατος από τα πρώιμα στάδια της νόσου, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου Β6 ποντικών, κάτι που επιβεβαιώθηκε από την ιστολογική ανάλυση των αρθρώσεων. Σε βιοχημικό επίπεδο, οι ποντικοί διατήρησαν υψηλά επίπεδα ολικής χοληστερόλης και σημαντικά μειωμένα επίπεδα HDL-χοληστερόλης, με παράλληλη μείωση της δραστηριότητας της PON-1. Επιπλέον, η ανάλυση κατανομής της ApoA-I στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα αποκάλυψε απόκλιση σε σχέση με την αναμενόμενη εντόπισής της. Η παρουσία της σε κλάσματα χαμηλής πυκνότητας, υποδηλώνει σημαντική αναδιοργάνωση και ποιοτική αλλοίωση των σωματιδίων HDL. Φαινοτυπική ανάλυση των σπληνικών μακροφάγων από ApoE KO ποντικούς ανέδειξε μεταβολές σε επιφανειακούς μάρτυρες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Στην κορύφωση της αρθρίτιδας παρατηρήθηκε ενισχυμένη έκφραση μορίων συνδιέγερσης CD86 και αντιγονο-παρουσίασης MHC-II, ενώ στο τελικό στάδιο τα ApoE KO μακροφάγα παρουσίασαν αυξημένη έκφραση των CD163 και CD86, που επίσης συνδέονται με ανοσολογική ενεργοποίηση. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι η υπερχοληστερολαιμία οδηγεί σε επαναπρογραμματισμό των μακροφάγων, ενισχύοντας την προφλεγμονώδη τους λειτουργία. Η χορήγηση σιμβαστατίνης (20 mg/kg/ημέρα, i.p. για 7 ημέρες) στους ApoE KO ποντικούς βελτίωσε το λιπιδαιμικό προφίλ, αποκατέστησε σε σημαντικό βαθμό τη λειτουργικότητα της PON-1 στην HDL και μείωσε τη βαρύτητα της αρθρίτιδας. Επιπλέον, το φαινοτυπικό προφίλ των μακροφάγων από τους ίδιους ποντικούς, έδειξε περιορισμό των χαρακτηριστικών που σχετίζονται με αυξημένη ανοσολογική ενεργοποίηση. Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν ότι η υπολιπιδαιμική θεραπεία δεν επιδρά μόνο στο μεταβολικό σκέλος της νόσου αλλά επηρεάζει άμεσα και τις ανοσολογικές διεργασίες. Συμπερασματικά, η παρούσα έρευνα καταδεικνύει ότι η υπερχοληστερολαιμία επιδρά στην φλεγμονώδη απάντηση στην ΡΑ μέσω αναδιαμόρφωσης της λειτουργίας των μακροφάγων και της ποιοτικής σύστασης των λιποπρωτεϊνών. Η κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ μεταβολισμού λιπιδίων και έμφυτης ανοσίας ενδέχεται να ανοίξει νέους θεραπευτικούς δρόμους που στοχεύουν ταυτόχρονα τη φλεγμονή και τη μεταβολική δυσλειτουργία μέσω βελτίωσης της δυσλιπιδαιμίας, με στόχο την καλύτερη πρόγνωση όχι μόνο της αρθρίτιδας αλλά και των καρδιαγγειακών επιπλοκών που τη συνοδεύουν. Συνολικά, η παρούσα διατριβή διερευνά την κρίσιμη αλληλεπίδραση μεταξύ του μεταβολισμού των λιπιδίων και της φλεγμονής στην παθογένεση της ΡΑ, αξιοποιώντας δύο διαφορετικά δυσλιπιδαιμικά μοντέλα μυών, το ApoC-III Tg και το ApoE KO. Η έρευνά μας καταδεικνύει ότι τόσο η υπερτριγλυκεριδαιμία όσο και η υπερχοληστερολαιμία επιδεινώνουν σημαντικά τη φλεγμονή και τη δομική βλάβη των αρθρώσεων. Παρά τις διαφορές των δύο μοντέλων, ταυτοποιήθηκε ένας κοινός υποκείμενος μηχανισμός, ο οποίος υποδηλώνει ότι, σε δυσλιπιδαιμικές συνθήκες, η HDL υφίσταται δομική και λειτουργική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη αντιοξειδωτική δραστικότητα της PON-1 και τροποποιημένη απολιποπρωτεϊνική σύσταση. Αυτή η ποιοτική απώλεια των προστατευτικών ιδιοτήτων της HDL καθοδηγεί τον επαναπρογραμματισμό των μακροφάγων προς έναν προφλεγμονώδη φαινότυπο. Κομβικής σημασίας είναι το εύρημα ότι οι στοχευμένες υπολιπιδαιμικές παρεμβάσεις όχι μόνο ανέστρεψαν τις λιπιδαιμικές ανισορροπίες, αλλά αποκατέστησαν επίσης τη λειτουργικότητα της HDL, μείωσαν την ενεργοποίηση των μακροφάγων και άμβλυναν επιτυχώς την κλινική και ιστολογική βαρύτητα της ΡΑ. Η παρούσα εργασία υπογραμμίζει ότι οι θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν στο λιπιδαιμικό προφίλ παρέχουν διπλό όφελος, μεταβολικό και ανοσολογικό, αποτελώντας μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τον περιορισμό τόσο της βαρύτητας της αρθρίτιδας όσο και των σχετιζόμενων με αυτήν καρδιαγγειακών κινδύνων στην κλινική πράξη.