Applications of omics technologies in the analysis of complex mixtures and the discovery of bioactive natural products

Abstract

Natural products remain a vital source of bioactive compounds for drug discovery, particularly in the field of infectious diseases. However, their chemical complexity and the limitations of conventional bioactivity-guided isolation approaches continue to hinder the efficient identification of pharmacologically relevant constituents. This thesis investigates advanced metabolomics and statistical spectroscopy tools to accelerate natural product drug discovery, with a focus on antiparasitic compounds from Artemisia plants. As a first step, an untargeted LC–HRMS/MS analysis was applied to selected Artemisia species native to Greece, providing a comprehensive overview of their secondary metabolite diversity and revealing chemotaxonomic relationships among species. Seventy secondary metabolites were tentatively identified across the different extracts. Screening against Leishmania spp. demonstrated that three ethyl acetate extracts exhibited significant antileishmanial activity, with A. umbelliformis subsp. eriantha extract displaying the lowest IC50 value. Based on these results, A. umbelliformis subsp. eriantha extract was selected for the application of a workflow combining HeteroCovariance Approach (HetCA) and Statistical Total Correlation Spectroscopy (STOCSY). By statistically correlating NMR spectral data from chromatographically generated extract fractions with antileishmanial activity results, this approach enabled the identification of bioactive constituents prior to isolation. Two sesquiterpene lactones, 5-deoxy-5-hydroperoxytelekin and telekin, emerged as the primary antileishmanial agents, exhibiting low micromolar activity and favorable selectivity index. Further phytochemical investigation of A. umbelliformis subsp. eriantha expanded its metabolite repertoire, yielding a novel compound and validated the robustness of HetCA-guided prioritization through additional antileishmanial assessments of the complementary compounds. The HetCA prioritized compounds, 5-deoxy-5-hydroperoxytelekin and telekin were additionally evaluated against Trypanosoma cruzi, demonstrating pronounced antitrypanosomal activity, supported by mechanistic insights involving oxidative stress and ultrastructural damage. Finally, HetCA and STOCSY were applied to A. arborescens extract to uncover bioactive compounds in extracts lacking measurable antileishmanial activity. The workflow enabled the detection, annotation, and targeted isolation of several lignans, including a novel compound. Among the isolated metabolites, sesamin demonstrated moderate antileishmanial activity, underscoring the ability of HetCA to transcend limitations of extract-level screening. Overall, this thesis highlights statistical spectroscopy–driven strategies as a powerful paradigm for natural product drug discovery, enabling the efficient dereplication of extract components and the identification of bioactive compounds prior to any isolation.

Τα φυσικά προϊόντα αποτελούν μια σημαντική πηγή βιοδραστικών ενώσεων για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων, ιδιαίτερα στον τομέα των λοιμωδών νοσημάτων. Ωστόσο, η χημική τους πολυπλοκότητα και οι περιορισμοί των συμβατικών προσεγγίσεων απομόνωσης καθοδηγούμενης από τη βιοδραστικότητα εξακολουθούν να δυσχεραίνουν την αποτελεσματική ταυτοποίηση φαρμακολογικά σημαντικών συστατικών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά προηγμένα εργαλεία μεταβολομικής και στατιστικής φασματοσκοπίας με στόχο την επιτάχυνση της ανακάλυψης φαρμάκων από φυσικά προϊόντα, εστιάζοντας σε αντιπαρασιτικές ενώσεις από φυτά του γένους Artemisia. Ως πρώτο βήμα, εφαρμόστηκε μη στοχευμένη ανάλυση LC–HRMS/MS σε επιλεγμένα είδη Artemisia ενδημικά της Ελλάδας, παρέχοντας μια ολοκληρωμένη επισκόπηση της ποικιλίας των δευτερογενών μεταβολιτών τους και αποκαλύπτοντας χημειοταξινομικές σχέσεις μεταξύ των ειδών. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν εβδομήντα δευτερογενείς μεταβολίτες στα διαφορετικά εκχυλίσματα. Ο έλεγχος έναντι ειδών του παρασίτου Leishmania έδειξε ότι τρία εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα παρουσίασαν σημαντική αντιλεϊσμανιακή δράση, με το εκχύλισμα του είδους A. umbelliformis subsp. eriantha να εμφανίζει τη χαμηλότερη τιμή IC50. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, το εκχύλισμα της A. umbelliformis subsp. eriantha επιλέχθηκε για την εφαρμογή ενός πρωτοκόλλου που συνδυάζει την προσέγγιση Ετεροσυνδιακύμανσης (HeteroCovariance Approach, HetCA) και τη Στατιστική Ολική Φασματοσκοπία Συσχέτισης (Statistical Total Correlation Spectroscopy, STOCSY). Μέσω της συγκεκριμένης προσέγγισης, φασματοσκοπικά δεδομένα NMR από χρωματογραφικά παραγόμενα κλάσματα του εκχυλίσματος συσχετίστηκαν στατιστικά με τα αντίστοιχα αποτελέσματα αντιλεϊσμανιακής δράσης, επιτρέποντας την ταυτοποίηση βιοδραστικών συστατικών πριν από την απομόνωσή τους. Δύο σεσκιτερπενικές λακτόνες, η 5-deoxy-5-hydroperoxytelekin και η telekin, αναδείχθηκαν ως οι κύριοι αντιλεϊσμανιακοί παράγοντες, παρουσιάζοντας δραστικότητα σε χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις και ευνοϊκό δείκτη εκλεκτικότητας. Η περαιτέρω φυτοχημική διερεύνηση της A. umbelliformis subsp. eriantha διεύρυνε το μεταβολικό προφίλ του εκχυλίσματος, οδηγώντας στην απομόνωση μιας νέας ένωσης, και επιβεβαίωσε την αξιοπιστία της καθοδηγούμενης από το HetCA ιεράρχησης, μέσω επιπλέον αξιολογήσεων της αντιλεϊσμανιακής δράσης των απομονωμενων ενώσεων. Οι ενώσεις που ιεραρχήθηκαν μέσω του HetCA, 5-deoxy-5-hydroperoxytelekin και telekin, αξιολογήθηκαν επίσης έναντι του παρασίτου Trypanosoma cruzi, επιδεικνύοντας ισχυρή αντιτρυπανοσωμιακή δράση, υποστηριζόμενη από μηχανιστικές ενδείξεις που περιλάμβαναν οξειδωτικό στρες και υπερδομικές βλάβες. Τέλος, οι μέθοδοι HetCA και STOCSY εφαρμόστηκαν στο εκχύλισμα της A. arborescens με στόχο την ανακάλυψη βιοδραστικών ενώσεων σε εκχυλίσματα που δεν εμφάνιζαν μετρήσιμη αντιλεϊσμανιακή δραστικότητα. Το πρωτόκολλο επέτρεψε την ανίχνευση, χημική αποσαφήνιση και στοχευμένη απομόνωση αρκετών λιγνανίων, συμπεριλαμβανομένης μίας νέας ένωσης. Μεταξύ των απομονωμένων μεταβολιτών, η sesamin παρουσίασε μέτρια αντιλεϊσμανιακή δράση, υπογραμμίζοντας την ικανότητα της HetCA να υπερβαίνει τους περιορισμούς της αξιολόγησης σε επίπεδο εκχυλίσματος. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αναδεικνύει τις στρατηγικές που βασίζονται στη στατιστική φασματοσκοπία ως ένα ισχυρό εργαλείο για την ανακάλυψη φαρμάκων από φυσικά προϊόντα, επιτρέποντας την αποτελεσματική ταχεία αναγνώριση (dereplication) των συστατικών των εκχυλισμάτων και την ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων πριν από οποιαδήποτε διαδικασία απομόνωσης.