Development, characterization and application of biocompatible co-polymers with cyclodextrins as carriers for nasal drug delivery in neurodegenerative diseases: in vitro, ex vivo and in vivo evaluation

Abstract

Parkinson’s disease (PAD) is one of the most prevalent neurodegenerative disorders, and current therapies are predominantly administered orally. However, oral delivery faces some limitations due to gastrointestinal (GI) and liver first-pass metabolism, plasma protein binding, as well as the presence of the blood-brain barrier (BBB), all of which reduce drug bioavailability and delay therapeutic onset in the brain. These challenges highlight the need for alternative delivery routes to improve drug bioavailability and enhance central nervous system (CNS) targeting.Intranasal (IN) administration has gained increasing attention as a non-invasive approach to overcoming these limitations. The direct anatomical connection between the olfactory epithelium and the CNS enables drug transport to the brain, making the nasal route particularly advantageous for molecules with poor BBB permeability.Furthermore, to improve the therapeutic efficacy of a drug in clinical practice, innovative drug delivery platforms need to be explored. Among them, formulations combining block copolymers with cyclodextrins (CDs) represent a novel class of drug carriers with several favorable characteristics, including high biocompatibility, enhanced drug-loading capacity, controlled or sustained release, improved colloidal stability, and superior permeability across biological barriers, enabling targeted delivery to specific tissues. Given these advantages, it was considered worthwhile investigating such systems in pharmacokinetic (PK) animal studies. The main objective and novelty of this PhD thesis involve the design and development of advanced drug delivery systems for nasal administration of ropinirole hydrochloride (RH) for managing PAD. The research focuses on exploring the combination of biocompatible block copolymers, commercially available Poloxamer 407 (P407) and synthetic poly(ethylene-oxide)-b-poly(e-caprolactone) (PEO-b-PCL) with CDs, namely methyl-β-CD (MβCD) and hydroxy propyl-β-cyclodextrin (HPβCD), and the surfactant Tween 80 (Tw80). These components are co-assembled to form a new class of advanced drug delivery systems.In this context, hybrid nasal drug delivery systems of polymer/Tw80/MβCD or polymer/Tw80/HPβCD were formulated. These systems create novel biomaterials and supramolecular structures with diverse morphologies, integrating the physicochemical and thermotropic properties of their components. This research also examined how variations in PEO-b-PCL composition influence physicochemical, morphological, drug-loading, and release properties. First, the colloidal dispersions of ternary systems (P407/Tw80/MβCD, P407/Tw80/HPβCD, PEO-b-PCL/Tw80/MβCD and PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD) were fabricated using the thin-film hydration method. An extensive physicochemical and morphological characterization was conducted. Their biocompatibility was assessed by conducting in vitro cytotoxicity studies. RH-loaded systems were subsequently prepared using the same preparation protocol, with two optimized system-to-RH weight ratios, selected based on preformulation results. In vitro release and ex vivo mucosal permeation of RH were assessed using Franz cells under simulating pH and temperature conditions of the nasal cavity. Additionally, RH nasal lyophilized formulations containing the commercially available P407, Tw80, and βCD derivatives were prepared, including blends with mannitol/lecithin spray-dried microparticles (MLMPs). SEM was used to analyze powder morphology, and in vitro/ex vivo tests examined material interactions and the impact of MLMPs on morphological and biopharmaceutical properties. Finally, the serum and brain pharmacokinetics of the optimized formulations were further studied after IN administration in mice in comparison to the oral route. The presentation of the study’s results is structured into four Parts (A–D). In the first part, “Part A: Introduction & Study design”, the rational of the study and a description of the study protocols and methodology is given together with the study’s objectives. In “Chapter 1: Introduction”, the most recent developments in nasal drug delivery and PAD are discussed, as well as a review of the use of CDs, polymers, and mixed CD–block copolymer systems in drug delivery is given. In “Chapter 2: Study design and Methodology” an overview of the study design and the basic theoretical aspects of the methodologies applied for the study is described. Furthermore, each chapter of parts “B–D" of the present thesis contains specific information about the experimental procedures and equipment used, to allow the independent comprehension of their application at each stage of the study. In brief, in Chapter 2 the following methodologies used in this thesis are described: •Preformulation studies, physicochemical and morphological characterization of colloidal dispersions •Physicochemical and morphological characterization of powders •Non-compartmental pharmacokinetic analysis •Animal studies: pharmacokinetic studies •Sample collection and handling procedures •Statistical data analysis The second, third, and fourth parts of the study presentation (Parts B, C & D) are structured into chapters, and each chapter is organized to be read independently. More specifically: “PART B: Design, Development and Nasal delivery of Ropinirole Poloxamer 407/Tween 80/Cyclodextrin systems for Parkinson’s disease in C57BL/6J mice”, consists of three chapters. The first one describes the development, the extensive physicochemical, morphological characterization and in vitro/ex vivo evaluation of hybrid P407/Tw80/CD/RH colloidal dispersions for potential use in PAD (Chapter 3). The second one presents the further formulation of colloidal dispersions into nasal powders and the evaluation of their morphological and biopharmaceutical characteristics (Chapter 4). Last, Chapter 5 presents the determination of the RH PK parameters after the administration of the optimized P407/Tw80/CD/RH formulations in C57BL/6J mice, in comparison to the oral and IN administration of RH solutions. The chapters are structured as follows: Chapter 3: Fabricating Polymer/Surfactant/Cyclodextrin Hybrid Particles for Possible Nose-To-Brain Delivery of Ropinirole Hydrochloride: In Vitro and Ex Vivo EvaluationRH is a non-ergolinic dopamine agonist used to manage PAD, and it is characterized by poor oral bioavailability. This study aimed to design and develop advanced drug delivery systems composed of P407, a non-ionic surfactant (Tw80), and CDs (MβCD or HPβCD) for possible brain targeting of RH after nasal administration. The hybrid systems were formed by the thin-film hydration method, followed by an extensive physicochemical and morphological characterization. The in vitro cytotoxicity of the systems on HEK293 cell lines was also tested. In vitro release and ex vivo mucosal permeation of RH were evaluated using Franz cells under simulated nasal cavity conditions (pH 5.6, 34 °C). The results indicated that the diffusion-controlled drug release exhibited a progressive increase throughout the experiment, while a proof-of-concept experiment on ex vivo permeation through rabbit nasal mucosa revealed a better performance of the prepared hybrid systems in comparison to RH solution. The encouraging results in drug release and mucosal permeation indicate that these hybrid systems can serve as attractive platforms for effective and targeted nose-to-brain delivery of RH with a possible application in PAD. Based on these encouraging results, other formulation strategies and further studies were performed to evaluate the effect of dose and formulation on the in vitro release and ex vivo permeation of RH through rabbit nasal mucosa, as well as the in vivo serum and brain PK profiles of the developed formulations after nasal administration. Chapter 4: Advanced P407/Tw80/βCD based Nasal Powders of Ropinirole Hydrochloride for Possible Nose-to-Brain Delivery in Parkinson’s disease: Preparation and Comprehensive In Vitro and Ex Vivo EvaluationThis study focused on the development of lyophilized nasal powders of RH, composed of P407 triblock copolymer, surfactant Tw80 and derivatives of βCD [MβCD or HPβCD] for managing PD. The lyophilized compositions were produced by freeze-drying of the corresponding colloidal dispersions. The innovative aspect of this research lies in the integration of these diverse biomaterials to develop advanced drug delivery systems for nasal administration. The optimal lyophilized formulations were blended with spray-dried MLMPs in various ratios. The blending process resulted in powders with improved morphological characteristics, as evidenced by scanning electron microscopy analysis. Nasal powders were characterized through in vitro diffusion and ex vivo permeation studies. Finally, a comparison between the nasal powders and the corresponding colloidal dispersions was held. Results showed that the lyophilized powders had a superior release profile compared to colloidal dispersions, and blending with MLMPs further enhanced this effect. Ex vivo powders' permeation across rabbit nasal mucosa was found to be more efficient compared to pure RH solution. In particular, the lyophilized formulation of (P407/Tw80/HPβCD)/RH 10:5 blended with MLMPs (25:75) achieved 54.40 ± 3.30% permeation of the loading dose and a mass balance of 98.15 ± 1.61%. This study demonstrates the potential of these formulations for effective nose-to-brain drug delivery. Further in vivo PK studies were conducted to assess the performance of the optimal formulations in an appropriate animal model. Chapter 5: Nasal administration of Ropinirole loaded P407/Tw80/HPβCD systems in C57BL/6J miceNasal administration has emerged as an effective alternative for drug delivery to CNS, particularly in neurodegenerative diseases. RH is used as a monotherapy or as an adjunctive combination with levodopa for the management of PAD. However, RH undergoes extensive first-pass metabolism, thereby limiting the amount of drug reaching the CNS. The purpose of the present study was the determination of the PK parameters of RH when administered intranasally as colloidal dispersion [(P407/Tw80/HPβCD)/RH 10:5] and as a powder [(P407/Tw80/HPβCD)/RH 10:5 blended with MLMPs (25:75)] for brain targeting. In particular, the PK study was carried out in comparison with oral (per os) and IN administration of pure RH solution in C57BL/6J mice. The brain and serum distribution pharmacokinetics of the drug were studied applying the sparse sampling non-compartmental analysis (NCA). The PK profiles after IN and per os administration revealed the efficiency of IN administration in rapidly and effectively delivering RH, both to the CNS and bloodstream. The pre-eminence of the nasal formulations is witnessed by higher serum AUC and Cmax values after IN administration of formulations compared to the per os administration of RH solution. Notably, the IN administration of the RH powder resulted in the highest systemic bioavailability (Frel(Serum) = 1497%) and brain exposure (Frel(Brain) = 541%), suggesting a promising role for nasal delivery in targeting the CNS.“PART C: Design, Development and Nasal delivery of Ropinirole PEO-b-PCL/Tween80/Cyclodextrin systems for Parkinson’s disease in C57BL/6J mice” consists of two chapters. The first chapter describes the development, the extensive physicochemical and morphological characterization of hybrid PEO-b-PCL/Tw80/CD/RH colloidal dispersions, along with their in vitro and ex vivo evaluation for potential use in PAD. It further investigates how variations in PEO-b-PCL composition affect physicochemical properties, morphology, drug-loading capacity, and release behavior (Chapter 6). The second chapter of part C presents the determination of RH PK parameters following administration of a selected PEO-b-PCL/Tw80/CD/RH formulations in C57BL/6J mice compared to both oral and IN administration of the RH solution (Chapter 7). The chapters are organized as follows: Chapter 6: PEO-b-PCL/Tween 80/Cyclodextrin systems: from bioinspired fabrication to possible nasal administration of Ropinirole Hydrochloride The present work investigates the combination of biocompatible block copolymers PEO-b-PCL with CDs, namely MβCD and HPβCD, to design and develop complex co-assembled structures that represent a new class of advanced drug delivery systems. The systems were formed by the thin-film hydration method. An extensive physicochemical and morphological characterization was conducted using differential scanning calorimetry, light scattering techniques, microcalorimetry analysis (mDSC), high-resolution ultrasound spectroscopy (HR-US), surface tension measurements, fluorescence spectroscopy, cryogenic transmission electron microscopy images, and in vitro cytotoxicity evaluation. These innovative hybrid colloidal dispersions were found to be attractive candidates as drug delivery systems with unique properties by encompassing the physicochemical and thermotropic properties of both classes of materials. In vitro diffusion experiments under pH and temperature conditions that mimic those of the human nasal cavity consistently demonstrated an effective release of RH from the formulations, with a mass balance exceeding 90% in most cases. Particularly, systems containing a 5 mg/mL concentration of RH and HPβCD exhibited superior in vitro release characteristics resembling those of the RH solution (0.5 mg/mL, pH 5.6). Ex vivo permeation studies using the rabbit nasal mucosa as a barrier confirmed that the developed formulations significantly enhanced RH permeation compared to the pure RH solution (0.5 mg/mL, pH 5.6). Among all tested formulations, those containing HPβCD were more effective than those with MβCD in enhancing RH permeation, identifying them as the most promising candidates for further investigation. These promising results enhance the potential of these hybrid, cutting-edge systems for nasal drug delivery applications. Subsequent in vivo PK profiles in both serum and brain were investigated following the nasal administration of the optimally developed formulations. Chapter 7: Nasal administration of Ropinirole loaded PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD systems in C57BL/6J miceIN administration has emerged as a promising drug delivery route, offering direct nose-to-brain transport, bypassing the BBB and first-pass metabolism, reducing enzymatic degradation, minimizing systemic exposure and peripheral side effects, and enabling more precise, rapid, and patient-friendly CNS targeting. Recent studies have demonstrated the potential of IN systems for PAD management. In this context, the aim of this study was to determine the PK parameters of RH, an antiparkinsonian drug, when administered intranasally as colloidal dispersion [(PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD/RH) 10:5] for possible nose-to-brain delivery, in comparison to the per os and IN administration of control RH solution in C57BL/6J mice. The brain and serum distribution PK parameters derived using NCA sparse data methodology illustrated that F12 colloidal dispersion significantly enhanced both systemic and brain exposure of RH, achieving higher serum AUC and Cmax values. Compared to per os administration, IN delivery of the colloidal dispersion achieved markedly higher drug concentrations in serum and brain tissue, even with a 3-fold lower administered dose. It showed high systemic (Frel(Serum) = 1815%) and brain (Frel(Brain) = 363%) relative bioavailability, underscoring its potential as an IN delivery system for efficient CNS targeting. “Part D: General conclusions, study limitations and future work” recapitulates the key findings of the study, discusses the limitations of the study, and suggests avenues for future investigation.

Η νόσος του Πάρκινσον αποτελεί μία από τις πιο συχνά εμφανιζόμενες νευροεκφυλιστικές παθήσεις, ενώ οι διαθέσιμες θεραπευτικές προσεγγίσεις χορηγούνται κατά κύριο λόγο από το στόμα. Ωστόσο, η από του στόματος χορήγηση αντιμετωπίζει σημαντικούς περιορισμούς, οι οποίοι οφείλονται στον μεταβολισμό πρώτης διόδου από το ήπαρ, τη δέσμευση των φαρμακευτικών μορίων από τις πρωτεΐνες του πλάσματος, καθώς και την παρουσία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Οι παράγοντες αυτοί συμβάλλουν στη μείωση της βιοδιαθεσιμότητας των φαρμακολογικά δραστικών ουσιών (ΦΔΟ) και στην καθυστέρηση της έναρξης της θεραπευτικής τους δράσης στον εγκέφαλο. Οι ανωτέρω περιορισμοί καθιστούν επιτακτική την ανάγκη διερεύνησης εναλλακτικών οδών χορήγησης, με στόχο τη βελτίωση της φαρμακοκινητικής συμπεριφοράς των ΦΔΟ και την αποτελεσματικότερη στόχευση του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Στο πλαίσιο αυτό, η ρινική χορήγηση έχει αναδειχθεί ως μια ιδιαίτερα ελκυστική, μη επεμβατική στρατηγική. Η άμεση ανατομική και λειτουργική σύνδεση του οσφρητικού επιθηλίου με το ΚΝΣ επιτρέπει τη μεταφορά ΦΔΟ απευθείας στον εγκέφαλο, παρακάμπτοντας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Συνεπώς, η ρινική οδός αναδεικνύεται ως ιδιαίτερα ευνοϊκή μέθοδος χορήγησης μορίων με περιορισμένη διαπερατότητα στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Επιπλέον, με στόχο τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας ενός φαρμάκου στην κλινική πράξη, καθίσταται αναγκαία η διερεύνηση καινοτόμων συστημάτων χορήγησης ΦΔΟ. Μεταξύ αυτών, τα φαρμακοτεχνικά συστήματα που συνδυάζουν συμπολυμερή κατά συστάδες με κυκλοδεξτρίνες αποτελούν μια νέα και ιδιαίτερα υποσχόμενη κατηγορία φορέων φαρμάκων. Ειδικότερα, τα συστήματα αυτά εμφανίζουν υψηλή βιοσυμβατότητα, αυξημένη ικανότητα φόρτωσης ΦΔΟ, δυνατότητα ελεγχόμενης ή παρατεταμένης αποδέσμευσης, κολλοειδή σταθερότητα, καθώς και ενισχυμένη διαπερατότητα μέσω βιολογικών φραγμών, επιτρέποντας τη στοχευμένη χορήγηση σε συγκεκριμένους ιστούς. Λαμβάνοντας υπόψη τα ανωτέρω πλεονεκτήματα, κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση των εν λόγω συστημάτων σε φαρμακοκινητικές μελέτες σε ζωικά πρότυπα. Ο κύριος στόχος και η καινοτομία της παρούσας διδακτορικής διατριβής εστιάζουν στον σχεδιασμό και την ανάπτυξη προηγμένων συστημάτων χορήγησης φαρμάκων για ρινική χορήγηση της υδροχλωρικής ροπινιρόλης (ΥΡ), με σκοπό τη θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου του Πάρκινσον. Η έρευνα επικεντρώνεται στη διερεύνηση του συνδυασμού βιοσυμβατών συμπολυμερών κατά συστάδες, και συγκεκριμένα του εμπορικά διαθέσιμου Poloxamer 407 (P407) και του συνθετικού πολυ(αιθυλενο-οξειδίου)-β-πολυ(ε-καπρολακτόνης) (PEO-b-PCL), με κυκλοδεξτρίνες (CDs) και ειδικότερα τη μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (MβCD) και την υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (HPβCD), καθώς και με την επιφανειοδραστική ουσία Πολυσορβικό 80 (Tween 80, Tw80). α συστήματα αυτά παρουσιάζουν ικανότητα αυτοσυναρμολόγησης, οδηγώντας στον σχηματισμό μιας νέας καινοτόμου κατηγορίας συστημάτων μεταφοράς ΦΔΟ. Στο πλαίσιο αυτό, αναπτύχθηκαν υβριδικά, ρινικά συστήματα χορήγησης ΦΔΟ τύπου πολυμερούς/Tw80/MβCD ή πολυμερούς/Tw80/HPβCD. Τα συστήματα αυτά οδηγούν στον σχηματισμό νέων βιοϋλικών και υπερμοριακών δομών με ποικίλη μορφολογία, ενσωματώνοντας τις φυσικοχημικές και θερμοτροπικές ιδιότητες των επιμέρους συστατικών τους. Παράλληλα, διερευνήθηκε η επίδραση της μεταβολής στη σύσταση του συμπολυμερούς PEO-b-PCL στις φυσικοχημικές, μορφολογικές και φαρμακοτεχνικές ιδιότητες των συστημάτων, καθώς και στην ικανότητα φόρτωσης της ΦΔΟ και στο προφίλ αποδέσμευσής της. Αρχικά, παρασκευάστηκαν κολλοειδείς διασπορές τριαδικών συστημάτων (P407/Tw80/MβCD, P407/Tw80/HPβCD, PEO-b-PCL/Tw80/MβCD και PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD) με τη μέθοδο ενυδάτωσης λεπτού υμενίου. Ακολούθησε ένας εκτενής φυσικοχημικός και μορφολογικός χαρακτηρισμός των συστημάτων, ενώ η βιοσυμβατότητά τους αξιολογήθηκε μέσω in vitro μελετών κυτταροτοξικότητας. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν συστήματα φορτωμένα με ΥΡ εφαρμόζοντας το ίδιο πρωτόκολλο παρασκευής. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές αναλογίες συστήματος προς ΥΡ (βάρος/βάρος), βάσει των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μελέτες προ μορφοποίησης. Το προφίλ της in vitro αποδέσμευσης και διάχυσης μέσω των μεμβρανών αναγεννημένης κυτταρίνης, αλλά και της ex vivo διαπερατότητας της ΥΡ μέσω του ρινικού βλεννογόνου κουνελιών, αξιολογήθηκαν με τη χρήση της διάταξης των κυττάρων Franz, υπό συνθήκες pH και θερμοκρασίας που προσομοιάζουν το περιβάλλον της ρινικής κοιλότητας. Επιπλέον, παρασκευάστηκαν ρινικές λυόφιλες κόνεις της ΥΡ, οι οποίες περιείχαν το εμπορικά διαθέσιμο P407, το Πολυσορβικό 80 (Tw80) και παράγωγα της β-κυκλοδεξτρίνης (βCD). Παρασκευάστηκαν επίσης και μείγματα των βέλτιστων λυόφιλων κόνεων με μικροσωματίδια μαννιτόλης/λεκιθίνης, τα οποία παρήχθησαν με τη μέθοδο της ξήρανσης δια ψεκασμού. Η μορφολογία των κόνεων αναλύθηκε με τη χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης. Η αξιολόγηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των επιμέρους υλικών, καθώς και η διερεύνηση της επίδρασης της παρουσίας των μικροσωματιδίων μαννιτόλης/λεκιθίνης στις μορφολογικές και βιοφαρμακευτικές ιδιότητες των συστημάτων, πραγματοποιήθηκαν με τη διεξαγωγή των in vitro μελετών διάχυσης και των ex vivo μελετών διαπερατότητας. Τέλος, προσδιορίστηκαν οι φαρμακοκινητικές παράμετροι της ΥΡ στον ορό και στον εγκέφαλο μετά τη ρινική χορήγηση των βελτιστοποιημένων φαρμακοτεχνικών συστημάτων σε ποντίκια και συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες τιμές που προέκυψαν μετά από τη ρινική και την από του στόματος χορήγηση διαλύματος ελέγχου της ΥΡ.Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης διαρθρώνεται σε τέσσερα Μέρη (Α–Δ). Στο πρώτο μέρος, «Μέρος Α: Εισαγωγή & Σχεδιασμός της Μελέτης», παρατίθεται το θεωρητικό υπόβαθρο της έρευνας και περιγράφονται τα πρωτόκολλα, οι μεθοδολογίες που εφαρμόστηκαν και οι στόχοι της μελέτης. Στο «Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή», συζητούνται οι πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα της ρινικής χορήγησης φαρμάκων και της νόσου του Πάρκινσον, ενώ παράλληλα παρατίθεται βιβλιογραφική ανασκόπηση σχετικά με τη χρήση των κυκλοδεξτρινών, των πολυμερών και των υβριδικών συστημάτων κυκλοδεξτρινών–συμπολυμερών κατά συστάδες ως συστήματα χορήγησης και μεταφοράς ΦΔΟ. Στο «Κεφάλαιο 2: Σχεδιασμός της Μελέτης και Μεθοδολογία», παρουσιάζεται συνοπτικά ο συνολικός σχεδιασμός της μελέτης και περιγράφονται οι βασικές θεωρητικές πτυχές των μεθόδων που εφαρμόστηκαν. Επιπλέον, κάθε κεφάλαιο των Μερών Β–Δ της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με τις πειραματικές διαδικασίες και τον χρησιμοποιούμενο εξοπλισμό, με σκοπό την η ανεξάρτητη και ολοκληρωμένη κατανόηση της εφαρμογής τους σε κάθε επιμέρους στάδιο της μελέτης. Συνοπτικά, στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται οι ακόλουθες μέθοδοι που εφαρμόστηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής: •Μελέτες προμορφοποίησης, καθώς και φυσικοχημικός και μορφολογικός χαρακτηρισμός των κολλοειδών διασπορών •Φυσικοχημικός και μορφολογικός χαρακτηρισμός των κόνεων •Μη διαμερισματική φαρμακοκινητική ανάλυση •Μελέτες σε ζωικά πρότυπα •Συλλογή βιολογικών ιστών και χειρισμός δειγμάτων •Στατιστική ανάλυση δεδομένωνΤο δεύτερο, τρίτο και τέταρτο μέρος της μελέτης (Μέρη Β, Γ και Δ) είναι δομημένα σε επιμέρους κεφάλαια, καθένα από τα οποία έχει οργανωθεί με τρόπο που να επιτρέπει την ανεξάρτητη ανάγνωσή του. Πιο συγκεκριμένα, το «Μέρος Β: Σχεδιασμός, ανάπτυξη και ρινική χορήγηση των συστημάτων P407/Tw80/CD ροπινιρόλης σε ποντίκια C57BL/6J για τον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον» αποτελείται από τρία κεφάλαια. Το πρώτο κεφάλαιο (Κεφάλαιο 3) περιγράφει την ανάπτυξη των υβριδικών κολλοειδών διασπορών P407/Tw80/CD/ΥΡ, καθώς και τον εκτενή φυσικοχημικό και μορφολογικό χαρακτηρισμό τους, σε συνδυασμό με την in vitro και ex vivo αξιολόγησή τους ως υποψήφια συστήματα για τον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον. Στο δεύτερο μέρος (Κεφάλαιο 4) παρουσιάζεται η περαιτέρω μορφοποίηση των κολλοειδών διασπορών σε ρινικές κόνεις, καθώς και η αξιολόγηση των μορφολογικών και βιοφαρμακευτικών τους χαρακτηριστικών. Τέλος, στο Κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται ο προσδιορισμός των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της ΥΡ μετά από ρινική χορήγηση των βελτιστοποιημένων φαρμακοτεχνικών συστημάτων P407/Tw80/CD/ΥΡ σε ποντίκια C57BL/6J, σε σύγκριση με την από του στόματος και τη ρινική χορήγηση των αντίστοιχων διαλυμάτων ελέγχου του φαρμάκου. Τα κεφάλαια δομούνται ως εξής: Κεφάλαιο 3: Παρασκευή υβριδικών συστημάτων πολυμερούς/επιφανειοδραστικής ουσίας/κυκλοδεξτρίνης για την πιθανή απευθείας μεταφορά της ΥΡ από τη μύτη προς τον εγκέφαλο: in vitro και ex vivo αξιολόγησηΗ ΥΡ είναι ένας μη εργολινικός αγωνιστής ντοπαμίνης που χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση της νόσου Πάρκινσον και χαρακτηρίζεται από χαμηλή από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη προηγμένων συστημάτων χορήγησης φαρμάκου αποτελούμενων από το P407, τη μη ιονική επιφανειοδραστική ουσία Tw80 και κυκλοδεξτρίνες (MβCD ή HPβCD), με στόχο την απευθείας μεταφορά της ΥΡ στον εγκέφαλο μέσω της ρινικής οδού χορήγησης. Τα υβριδικά συστήματα παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο ενυδάτωσης λεπτού υμενίου και υποβλήθηκαν σε εκτενή φυσικοχημικό και μορφολογικό χαρακτηρισμό. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η in vitro κυτταροτοξικότητα των συστημάτων σε κυτταρικές σειρές HEK293. Η in vitro αποδέσμευση και διάχυση της ΥΡ μέσω μεμβρανών αναγεννημένης κυτταρίνης, καθώς και η ex vivo διαπερατότητά της μέσω του ρινικού βλεννογόνου κουνελιών, μελετήθηκαν με τη χρήση διάταξης κυττάρων τύπου Franz, υπό συνθήκες pH και θερμοκρασίας που προσομοιώνουν το περιβάλλον της ρινικής κοιλότητας (pH 5,6 και 34 °C). Η in vitro αποδέσμευση και διάχυση της ΥΡ μέσω μεμβρανών αναγεννημένης κυτταρίνης, καθώς και η ex vivo διαπερατότητα της μέσω του ρινικού βλεννογόνου κουνελιών, αξιολογήθηκαν με τη χρήση της διάταξης των κυττάρων τύπου Franz, υπό συνθήκες pH και θερμοκρασίας που προσομοιάζουν το περιβάλλον της ρινικής κοιλότητας (pH 5.6, 34 °C). Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η αποδέσμευση της ΥΡ ήταν ελεγχόμενη από τη διάχυση και παρουσίασε προοδευτική αύξηση καθ’ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Στις ex vivo μελέτες διαπερατότητας, η ΥΡ εμφάνισε σημαντικά αυξημένα ποσοστά διαπέρασης όταν ήταν ενσωματωμένη στα υβριδικά συστήματα, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα διαλύματα ελέγχου του φαρμάκου. Τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα υβριδικά αυτά συστήματα μπορούν να αποτελέσουν ελκυστικές πλατφόρμες για την αποτελεσματική χορήγηση και μεταφορά της ΥΡ στον εγκέφαλο μέσω της ρινικής οδού, με πιθανή εφαρμογή στη αντιμετώπιση της νόσου του Πάρκινσον. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκαν επιπλέον στρατηγικές μορφοποίησης των συστημάτων και πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω μελέτες για την αξιολόγηση της επίδρασης της δόσης και της σύστασης των συστημάτων στον προφίλ της in vitro αποδέσμευσης και της ex vivo διαπερατότητας της ΥΡ. Τέλος, διεξήχθη φαρμακοκινητική μελέτη στον ορό και στον εγκέφαλο κατάλληλου ζωικού προτύπου μετά από χορήγηση των βέλτιστων συστημάτων, σε σύγκριση με την από του στόματος και τη ρινική χορήγηση διαλυμάτων ελέγχου ροπινιρόλης. Κεφάλαιο 4: Υβριδικές ρινικές κόνεις P407/Tw80/βCD για την πιθανή χορήγηση και απευθείας μεταφορά της ΥΡ από τη μύτη προς τον εγκέφαλο με σκοπό τον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον: in vitro και ex vivo αξιολόγηση Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη λυόφιλων ρινικών κόνεων ΥΡ, αποτελούμενων από το συμπολυμερές P407, την μη ιονική επιφανειοδραστική ουσία Tw80 και παράγωγα της β-CD (MβCD ή HPβCD), με στόχο τον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον. Οι ρινικές κόνεις παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της λυοφιλοποίησης των αντίστοιχων κολλοειδών διασπορών. Η καινοτομία της παρούσας έρευνας έγκειται στον συνδυασμό των ανωτέρω βιοϋλικών για την ανάπτυξη υβριδικών καινοτόμων ρινικών συστημάτων χορήγησης ΦΔΟ. Επιπλέον, παρασκευάστηκαν μείγματα των βέλτιστων λυόφιλων κόνεων με μικροσωματίδια μαννιτόλης/λεκιθίνης, τα οποία παρήχθησαν με τη μέθοδο της ξήρανσης δια ψεκασμού. Η διαδικασία της ανάμιξης οδήγησε στον σχηματισμό κόνεων με βελτιωμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά, όπως επιβεβαιώθηκε μέσω ανάλυσης με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Οι ρινικές κόνεις αξιολογήθηκαν μέσω in vitro μελετών διάχυσης και ex vivo μελετών διαπερατότητας. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε συγκριτική αξιολόγηση μεταξύ των λυόφιλων ρινικών κόνεων και των αντίστοιχων κολλοειδών διασπορών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι λυόφιλες κόνεις παρουσίασαν βελτιωμένο προφίλ αποδέσμευσης της ΥΡ σε σύγκριση με τις κολλοειδείς διασπορές, ενώ η ανάμιξη με τα μικροσωματίδια μαννιτόλης/λεκιθίνης ενίσχυσε περαιτέρω αυτό το προφίλ. Επιπλέον, η ΥΡ εμφάνισε αυξημένη ex vivo διαπερατότητα μέσω του ρινικού βλεννογόνου κουνελιών όταν ήταν ενσωματωμένη στις ρινικές κόνεις, σε σύγκριση με το διάλυμα ελέγχου του φαρμάκου. Ειδικότερα, το μείγμα της λυόφιλης κόνις (P407/Tw80/HPβCD)/ΥΡ σε αναλογία 10:5 με μικροσωματίδια μαννιτόλης/λεκιθίνης σε αναλογία 25:75, παρουσίασε ποσοστό διαπέρασης ίσο με 54.40 ± 3.30% της δόσης φόρτωσης της ΥΡ και ισοζύγιο μάζας 98.15 ± 1.61%. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν τη δυναμική των συγκεκριμένων υβριδικών ρινικών συστημάτων για την αποτελεσματική μεταφορά της ΥΡ από τη ρινική κοιλότητα απευθείας στον εγκέφαλο. Περαιτέρω in vivo φαρμακοκινητικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν με σκοπό την αξιολόγηση των βέλτιστων συστημάτων σε κατάλληλο ζωικό πρότυπο. Κεφάλαιο 5: Ρινική χορήγηση συστημάτων P407/Tw80/HPβCD φορτωμένων με ροπινιρόλη σε ποντίκια C57BL/6JΗ ρινική χορήγηση έχει αναδειχθεί ως μια αποτελεσματική εναλλακτική οδός για τη χορήγηση φαρμάκων στο ΚΝΣ, ειδικά για τη χρήση σε νευροεκφυλιστικές νόσους. Η ΥΡ χρησιμοποιείται ως μονοθεραπεία ή ως συμπληρωματική θεραπεία σε συνδυασμό με τη λεβοντόπα για τη διαχείριση της νόσου του Πάρκινσον. Ωστόσο, η ΥΡ υφίσταται εκτεταμένο μεταβολισμό πρώτης διόδου, γεγονός που περιορίζει σημαντικά την ποσότητα φαρμάκου που φτάνει στο ΚΝΣ. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της ΥΡ μετά από ρινική χορήγηση προηγμένων φαρμακοτεχνικών συστημάτων, και συγκεκριμένα ως κολλοειδούς διασποράς [(P407/Tw80/HPβCD)/ΥΡ 10:5] και ως ρινικής κόνις [μείγμα της λυόφιλης κόνις (P407/Tw80/HPβCD)/ΥΡ 10:5 με μικροσωματίδια μαννιτόλης/λεκιθίνης σε αναλογία 25:75], με στόχο την απευθείας μεταφορά της ΥΡ στον εγκέφαλο. Η φαρμακοκινητική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε σύγκριση με την από του στόματος και τη ρινική χορήγηση διαλύματος ελέγχου του φαρμάκου σε ποντίκια C57BL/6J. Η φαρμακοκινητική κατανομή του φαρμάκου στον εγκέφαλο και στον ορό μελετήθηκε με την εφαρμογή της μη-διαμερισματικής φαρμακοκινητικής ανάλυσης, χρησιμοποιώντας της μεθοδολογία αραιής δειγματοληψίας για το σύνολο των in vivo δεδομένων. Τα φαρμακοκινητικά προφίλ που προέκυψαν μετά τη ρινική και την από του στόματος χορήγηση έδειξαν την αποτελεσματικότητα της ρινικής οδού στην ταχεία και αποδοτική μεταφορά της ΥΡ τόσο στη συστηματική κυκλοφορία όσο και στο ΚΝΣ. Η υπεροχή των ρινικών σκευασμάτων τεκμηριώθηκε από τις υψηλότερες τιμές AUC (περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνου) και Cmax (μέγιστη συγκέντρωση) στον ορό μετά από ρινική χορήγηση των σκευασμάτων σε σύγκριση με την από του στόματος χορήγηση του διαλύματος φαρμάκου. Αξιοσημείωτο είναι είναι το γεγονός ότι η ρινική χορήγηση της κόνις οδήγησε στη μεγαλύτερη συστηματική βιοδιαθεσιμότητα (1497%) και στη μέγιστη έκθεση του εγκεφάλου (541%), αναδεικνύοντας τη δυναμική της ρινικής οδού και των αναπτυγμένων συστημάτων για τη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων στο ΚΝΣ. «Μέρος Γ: Σχεδιασμός, ανάπτυξη και ρινική χορήγηση των συστημάτων PEO-b-PCL/Tw80/CD ροπινιρόλης σε ποντίκια C57BL/6J για τον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον» αποτελείται από δύο κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο (Κεφάλαιο 6) περιγράφεται η ανάπτυξη των υβριδικών PEO-b-PCL/Tw80/CD/ΥΡ κολλοειδών διασπορών, καθώς και ο εκτενής φυσικοχημικός και μορφολογικός χαρακτηρισμός τους, σε συνδυασμό με την in vitro και ex vivo αξιολόγησή τους ως υποψήφια συστήματα για την πιθανή χρήση στον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον. Στο δεύτερο μέρος (Κεφάλαιο 7) παρουσιάζεται ο προσδιορισμός των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της ΥΡ μετά τη χορήγηση των βελτιστοποιημένων ρινικών μορφοποιήσεων PEO-b-PCL/Tw80/CD/ΥΡ σε ποντίκια C57BL/6J, σε σύγκριση με την από του στόματος και την ρινική χορήγηση των διαλυμάτων ελέγχου του φαρμάκου. Τα κεφάλαια δομούνται ως εξής: Κεφάλαιο 6: Συστήματα PEO-b-PCL/Tween 80/Κυκλοδεξτρίνης: από τη βιοεμπνευσμένη παρασκευή έως τη δυνητική ρινική χορήγηση της υδροχλωρικής ροπινιρόληςΗ παρούσα εργασία διερευνά τον συνδυασμό βιοσυμβατών συμπολυμερών κατά συστάδες PEO-b-PCL με κυκλοδεξτρίνες, και συγκεκριμένα τη MβCD και την HPβCD, με στόχο τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη πολύπλοκων υπερμοριακών δομών που αντιπροσωπεύουν μια νέα κατηγορία προηγμένων συστημάτων χορήγησης φαρμάκων. Τα συστήματα παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο ενυδάτωσης λεπτού υμενίου. Ακολούθησε εκτενής φυσικοχημικός και μορφολογικός χαρακτηρισμός των υβριδικών κολλοειδών διασπορών, με τη χρήση διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης, τεχνικών σκέδασης φωτός, μικροθερμιδομετρίας, φασματοσκοπίας υπερήχων υψηλής ανάλυσης, μετρήσεων επιφανειακής τάσης, φασματοσκοπίας φθορισμού και κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης, καθώς και αξιολόγηση της in vitro κυτταροτοξικότητάς τους. Τα καινοτόμα αυτά συστήματα αναδείχθηκαν ως ελκυστικοί υποψήφιοι φορείς μεταφοράς ΦΔΟ, καθώς ενσωματώνουν και συνδυάζουν τις φυσικοχημικές και θερμοτροπικές ιδιότητες όλων των επιμέρους κατηγοριών υλικών. Οι in vitro μελέτες αποδέσμευσης και διάχυσης της ΥΡ από μεμβράνες αναγεννημένης κυτταρίνης, υπό συνθήκες pH και θερμοκρασίας που προσομοιάζουν το περιβάλλον της ανθρώπινης ρινικής κοιλότητας, έδειξαν την αποτελεσματική αποδέσμευση του φαρμάκου από τα εξεταζόμενα συστήματα. Το ισοζύγιο μάζας υπερέβη το 90% στις περισσότερες περιπτώσεις. Ειδικότερα, τα συστήματα που περιείχαν ΥΡ σε συγκέντρωση 5 mg/mL και HPβCD παρουσίασαν βελτιωμένα in vitro προφίλ αποδέσμευσης και διάχυσης, συγκρίσιμα με εκείνα του διαλύματος ελέγχου της ΥΡ (0.5 mg/mL, pH 5.6). Επιπλέον, οι ex vivo μελέτες διαπερατότητας, με χρήση ρινικού βλεννογόνου κουνελιού ως φραγμού, επιβεβαίωσαν ότι η ΥΡ εμφάνισε σημαντικά ενισχυμένη διαπέραση όταν ήταν ενσωματωμένη στα υπό μελέτη συστήματα, σε σύγκριση με το αντίστοιχο διάλυμα ελέγχου (0.5 mg/mL, pH 5.6). Μεταξύ όλων των συστημάτων που αξιολογήθηκαν, εκείνα που περιείχαν HPβCD αποδείχθηκαν πιο αποτελεσματικά από τα αντίστοιχα με MβCD στην ενίσχυση της διαπερατότητας της ΥΡ, αναδεικνύοντάς τα ως τα πλέον υποσχόμενα για περαιτέρω διερεύνηση. Συνολικά, τα ενθαρρυντικά αυτά ευρήματα αναδεικνύουν τη δυναμική των υβριδικών, τεχνολογικά προηγμένων συστημάτων ως υποψήφιων φορέων για εφαρμογές ρινικής χορήγησης φαρμάκων. Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν in vivo φαρμακοκινητικές μελέτες, με στόχο την αξιολόγηση των βέλτιστων συστημάτων σε κατάλληλο ζωικό μοντέλο. Κεφάλαιο 7: Ρινική χορήγηση συστημάτων PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD φορτωμένων με ροπινιρόλη σε ποντίκια C57BL/6JΗ ρινική χορήγηση έχει αναδειχθεί ως μια ιδιαίτερα υποσχόμενη οδός χορήγησης ΦΔΟ, καθώς επιτρέπει την απευθείας μεταφορά τους από τη ρινική κοιλότητα στον εγκέφαλο, παρακάμπτοντας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και τον μεταβολισμό πρώτης διόδου. Παράλληλα, μειώνει την ενζυμική αποικοδόμηση, περιορίζει τη συστηματική έκθεση και τις περιφερικές ανεπιθύμητες ενέργειες, ενώ προσφέρει μια πιο στοχευμένη, ταχεία και φιλική προς τον ασθενή προσέγγιση για τη διαχείριση νευρολογικών παθήσεων. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τη δυναμική των ρινικών συστημάτων στον έλεγχο της νόσου του Πάρκινσον. Στο πλαίσιο αυτό, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των φαρμακοκινητικών παραμέτρων της ροπινιρόλης, ενός αντιπαρκινσονικού φαρμάκου, όταν χορηγείται ρινικά υπό τη μορφή κολλοειδούς διασποράς F12 [(PEO-b-PCL/Tw80/HPβCD/ΥΡ) 10:5] με στόχο τη διερεύνηση της πιθανής μεταφοράς της από τη μύτη στον εγκέφαλο. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα που προέκυψαν από την από του στόματος και τη ρινική χορήγηση διαλύματος ελέγχου της ΥΡ σε ποντίκια C57BL/6J. Οι φαρμακοκινητικές παράμετροι κατανομής της ΥΡ στον ορό και στον εγκέφαλο προσδιορίστηκαν με την εφαρμογή μη διαμερισματικής ανάλυσης με αραιή δειγματοληψία. Σε σύγκριση με την από του στόματος χορήγηση, η ρινική χορήγηση της κολλοειδούς διασποράς οδήγησε σε σημαντικά αυξημένες συγκεντρώσεις του φαρμάκου τόσο στον ορό όσο και στον εγκεφαλικό ιστό, παρά το γεγονός ότι χορηγήθηκε υποτριπλάσια δόση. Ειδικότερα, η κολλοειδής διασπορά παρουσίασε υψηλή σχετική συστηματική βιοδιαθεσιμότητα (1815%), καθώς και σημαντικά αυξημένη εγκεφαλική βιοδιαθεσιμότητα (363%), αναδεικνύοντας τη δυνατότητα αξιοποίησης του συγκεκριμένου ρινικού συστήματος χορήγησης για την αποτελεσματική στόχευση του ΚΝΣ. “Μέρος Δ: Γενικά συμπεράσματα, περιορισμοί της μελέτης και μελλοντικά βήματα”. Το παρόν μέρος συνοψίζει τα κύρια ευρήματα της μελέτης, αναλύει τους περιορισμούς της και προτείνει κατευθύνσεις για μελλοντική έρευνα.