Study of the bioactivity and toxicity of natural compounds in in vitro and in vivo systems

Abstract

Chios mastic (CM), the resin produced by Pistacia Lentiscus L., exerts several pharmacological activities that have been confirmed by numerous studies, however studies examining the toxicity of the product to support prospective pharmaceutical applications of CM are scarce. This thesis evaluates the safety of Chios mastic (CM) in Wistar rats through a tiered approach: a) an in vivo acute oral limit test, b) an in vivo bone-marrow micronucleus assay limit test, and c) a 90-day subchronic in vivo study focusing on liver effects. Chapter 2 assesses potential toxic effects of CM and characterizes potential biochemical disturbances in plasma and liver after the acute oral administration to Wistar rats at the limit dose. A limit test of the acute toxic class method was performed according to the OECD TG 423 with some modifications. Six male Wistar rats were orally administered by gavage a single dose of 2000 mg/kg bw CM, while five rats received the vehicle, followed by the clinical observation of the animals for 2 weeks. For metabolomics and histological study, blood was collected intermittently, and liver was sampled following the euthanasia of rats. During the observation period, no mortality or clinical signs of toxicity were observed. No statistical difference was observed in the body weight or organ weight of treated rats in comparison to the control group. The only tissue examined for histopathological alterations was the liver, which showed diffuse cytoplasmic clearing in 2 out of 6 treated rats suggesting glycogen accumulation. Plasma metabolomics study mainly indicated alterations in lipid metabolism in the treated group, affecting pathways of primary bile acid biosynthesis, linoleic acid metabolism and arachidonic acid metabolism. Lipid metabolism was also affected in liver of treated rats, altering primary bile acid biosynthesis pathway. CM can be classified in Category 5 (with an acute toxicity >2000-5000 mg/kg bw) or Unclassified according to OECD TG 423. In the absence of clinical signs of toxicity and gross organ pathology in treated group no target organs were identified. Metabolic perturbations of bile acid homeostasis were possibly associated with glycogen accumulation in the liver, which can be an adaptive response to the high dosing of CM. Chapter 3 investigates the genotoxicity of CM applying the limit test on the mammalian erythrocyte micronucleus assay in male Wistar rats. CM was administered by gavage to 5 rats at 2000 mg/kg bw for 3 days, while 5 rats received the vehicle and 5 rats received cyclophosphamide (positive control). Satellite groups of 3 rats were included for the negative control and CM-treated groups to collect plasma and bone marrow for chemical analyses. All rats were observed for mortality and clinical signs of toxicity during the dosing period. Rats were euthanatized 20 hours after the last treatment, necropsied, and bone marrow was collected for smear preparation. No mortality, clinical signs of toxicity, gross organ pathology, or body weight changes were observed in CM-treated rats compared to the negative control group. No statistically significant alteration of polychromatic erythrocytes (PCE) and the per-thousand incidences of micronucleated PCE in the bone marrow of CM-treated rats were observed. Bone marrow exposure to CM was unambiguously confirmed by the detection of the characteristic CM triterpenic acids in both bone marrow extract and plasma of CM-treated rats by UHPLCHRMS/MS analysis. In conclusion, no genotoxicity of CM was observed at the limit dose of 2000mg/kg bw on bone marrow erythrocytes. Chapter 4 examines the subchronic toxicity of CM in Wistar rats following 90 day oral administration via gavage at doses 0, 100, 400 and 1000 mg/kg bw in five groups of 10 animals per dose and sex. Body weight and clinical signs of toxicity were monitored during the dosing period, and gross necropsy, clinical pathology, liver histology and gene expression of Phase I liver metabolizing enzymes were studied. No mortality was observed in any of the tested doses, but moderate morbidity was observed in 1/10 male rats of the high dose group on week 5-7. In addition, decreased food consumption and body weight were observed on week 5, suggesting a transient toxicity in high dose male rats. The high dose affected the body weight of male rats, resulting in a significant decreased total body weight at the end of the study. Body weight of the medium dose female rats also showed significant decreases, however terminal body weight was not different from controls. Gross necropsy showed morphological alterations in small intestine of male and female high-dose groups. Clinical pathology parameters associated with liver damage were not increased in either male or female rats, suggesting no plausible liver injury. Liver histology of the high dose groups showed no significant alterations in males, while few mononuclear cell infiltrates were observed in 7/10 female rats, suggesting a minimal treatment-related inflammation in the liver. Gene expression analysis in the liver of the high dosed groups showed no significant alterations in P450 enzymes, apart from a significant induction in Cyp3a3 expression in both sexes. However, the human relevance of this finding is not fully elucidated. No induction of P450 enzymes involved in procarcinogen activation was determined. Overall, subchronic administration of CM to Wistar rats up to 400mg/kg bw did not show any signs of toxicity or effect at liver. The specific dose level corresponds to a daily consumption of approximately 24 gr of CM in human for 90 days, which is at least 10 times higher than the recommended dose for human consumption of 1- 2 gr for 15 days as traditional herbal medicinal product. Collectively, CM showed no acute toxicity and in vivo genotoxicity at the limit dose and was generally well tolerated over 90 days, with minimal, largely adaptive or transient findings mainly confined to the highest dose.

Η μαστίχα Χίου (ΜΧ), η ρητίνη που παράγεται από το Pistacia lentiscus L., παρουσιάζει ποικίλες φαρμακολογικές δράσεις οι οποίες έχουν επιβεβαιωθεί από πολυάριθμες μελέτες· ωστόσο, οι μελέτες που διερευνούν την τοξικότητα του προϊόντος με σκοπό την υποστήριξη μελλοντικών φαρμακευτικών εφαρμογών της ΜΧ είναι περιορισμένες. Η παρούσα διατριβή αξιολογεί την ασφάλεια της μαστίχας Χίου σε επίμυες Wistar μέσω μιας κλιμακωτής προσέγγισης: α) in vivo δοκιμή οξείας τοξικότητας από του στόματος σε οριακή δόση, β) in vivo δοκιμή μικροπυρήνων μυελού των οστών σε οριακή δόση και γ) υποχρόνια in vivo μελέτη τοξικότητας διάρκειας 90 ημερών με έμφαση στις ηπατικές επιδράσεις. Το Κεφάλαιο 2 αξιολογεί τις πιθανές τοξικές επιδράσεις της MX και χαρακτηρίζει ενδεχόμενες βιοχημικές διαταραχές στο πλάσμα και το ήπαρ μετά από οξεία από του στόματος χορήγηση σε επίμυες Wistar στην οριακή δόση. Πραγματοποιήθηκε δοκιμή ορίου της μεθόδου οξείας τοξικότητας σύμφωνα με την κατευθυντήρια οδηγία OECD TG 423, με ορισμένες τροποποιήσεις. Έξι αρσενικοί επίμυες Wistar έλαβαν εφάπαξ από του στόματος χορήγηση μέσω καθετήρα δόση 2000 mg/kg σωματικού βάρους MX, ενώ πέντε επίμυες έλαβαν τον φορέα, και ακολούθησε κλινική παρακολούθηση των ζώων για διάστημα δύο εβδομάδων. Για τη μεταβολομική και ιστολογική μελέτη, συλλέχθηκε αίμα σε διαστήματα, ενώ το ήπαρ ελήφθη μετά την ευθανασία των ζώων. Κατά την περίοδο παρατήρησης δεν παρατηρήθηκε θνησιμότητα ούτε κλινικά σημεία τοξικότητας. Δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στο σωματικό βάρος ή στο βάρος των οργάνων των ζώων που έλαβαν θεραπεία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Το μοναδικό όργανο που εξετάστηκε ιστοπαθολογικά ήταν το ήπαρ, στο οποίο παρατηρήθηκε διάχυτη κυτταροπλασματική διαύγαση σε 2 από τους 6 επίμυες που έλαβαν ΜΧ, υποδηλώνοντας συσσώρευση γλυκογόνου. Η μεταβολομική ανάλυση πλάσματος κατέδειξε κυρίως διαταραχές στον μεταβολισμό των λιπιδίων στην ομάδα που έλαβε θεραπεία, επηρεάζοντας οδούς βιοσύνθεσης πρωτογενών χολικών οξέων, μεταβολισμού του λινελαϊκού οξέος και του αραχιδονικού οξέος. Αντίστοιχες διαταραχές στον μεταβολισμό των λιπιδίων παρατηρήθηκαν και στο ήπαρ, με μεταβολές στην οδό βιοσύνθεσης πρωτογενών χολικών οξέων. Η ΜΧ μπορεί να ταξινομηθεί στην Κατηγορία 5 (με οξεία τοξικότητα >20005000 mg/kg σωματικού βάρους) ή ως μη ταξινομημένη σύμφωνα με την OECD TG 423 οδηγία. Ελλείψει κλινικών σημείων τοξικότητας και μακροσκοπικής παθολογίας των οργάνων στα ζώα που έλαβαν θεραπεία, δεν ταυτοποιήθηκαν όργανα-στόχοι. Οι μεταβολικές διαταραχές της ομοιόστασης των χολικών οξέων ενδέχεται να συσχετίζονται με τη συσσώρευση γλυκογόνου στο ήπαρ, η οποία πιθανόν αποτελεί προσαρμοστική απόκριση στη χορήγηση υψηλής δόσης μαστίχας. Το Κεφάλαιο 3 διερευνά τη γονοτοξικότητα της ΜΧ εφαρμόζοντας τη δοκιμασία μικροπυρήνων σε ερυθροκύτταρα θηλαστικών σε αρσενικούς επίμυες Wistar στην οριακή δόση. Η ΜΧ χορηγήθηκε από του στόματος μέσω καθετήρα σε 5 επίμυες σε δόση 2000 mg/kg σωματικού βάρους για 3 ημέρες, ενώ 5 επίμυες έλαβαν τον φορέα και 5 επίμυες κυκλοφωσφαμίδη (θετικός μάρτυρας). Περιλήφθηκαν δορυφορικές ομάδες 3 επίμυων για την ομάδα αρνητικού μάρτυρα και την ομάδα της ΜΧ, με σκοπό τη συλλογή πλάσματος και μυελού των οστών για χημικές αναλύσεις. Όλοι οι επίμυες παρακολουθήθηκαν για θνησιμότητα και κλινικά σημεία τοξικότητας κατά την περίοδο χορήγησης. Οι επίμυες ευθανατώθηκαν 20 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση, υποβλήθηκαν σε νεκροψία και συλλέχθηκε μυελός των οστών για την παρασκευή επιχρισμάτων. Δεν παρατηρήθηκε θνησιμότητα, κλινικά σημεία τοξικότητας, μακροσκοπική παθολογία οργάνων ή μεταβολές στο σωματικό βάρος στους επίμυες που έλαβαν ΜΧ σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού μάρτυρα. Δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική μεταβολή στο ποσοστό των πολυχρωματικών ερυθροκυττάρων ούτε στη συχνότητα μικροπυρηνοφόρων πολυχρωματικών ερυθροκυττάρων ανά χίλια κύτταρα στον μυελό των οστών των επίμυων που έλαβαν ΜΧ. Η έκθεση του μυελού των οστών στην ΜΧ επιβεβαιώθηκε μέσω της ανίχνευσης των χαρακτηριστικών τριτερπενικών οξέων της ΜΧ τόσο στα εκχυλίσματα μυελού των οστών όσο και στο πλάσμα των επίμυων που έλαβαν ΜΧ με ανάλυση UHPLC-HRMS/MS. Συμπερασματικά, δεν παρατηρήθηκε γονοτοξικότητα της ΜΧ στην οριακή δόση των 2000 mg/kg σωματικού βάρους στα ερυθροκύτταρα του μυελού των οστών των επίμυων. Το Κεφάλαιο 4 εξετάζει την υποχρόνια τοξικότητα της MX σε επίμυες Wistar μετά από του στόματος χορήγηση μέσω καθετήρα για 90 ημέρες σε δόσεις 0, 100, 400 και 1000 mg/kg σωματικού βάρους, σε πέντε ομάδες των 10 ζώων ανά δόση και φύλο. Το σωματικό βάρος και κλινικά σημεία τοξικότητας παρακολουθήθηκαν κατά τη διάρκεια της χορήγησης, ενώ στο τέλος του πειράματος πραγματοποιήθηκαν μακροσκοπική νεκροψία, βιοχημικές εξετάσεις, ιστολογική εξέταση του ήπατος και μελέτη της γονιδιακής έκφρασης ενζύμων Φάσης Ι του μεταβολισμού στο ήπαρ. Δεν παρατηρήθηκε θνησιμότητα σε καμία από τις δόσεις· ωστόσο, μέτρια νοσηρότητα παρατηρήθηκε σε 1/10 αρσενικούς επίμυες της ομάδας υψηλής δόσης κατά τις εβδομάδες 5–7. Επιπλέον, μειωμένη πρόσληψη τροφής και μείωση σωματικού βάρους παρατηρήθηκαν την 5η εβδομάδα στην ομάδα υψηλής δόσης των αρσενικών επίμυων, υποδηλώνοντας παροδική τοξικότητα. Η υψηλή δόση επηρέασε το σωματικό βάρος των αρσενικών επίμυων, οδηγώντας σε σημαντική μείωση του συνολικού σωματικού βάρους στο τέλος της μελέτης. Το σωματικό βάρος των θηλυκών επίμυων της μεσαίας δόσης επίσης έδειξε σημαντικές μειώσεις, ωστόσο το τελικό σωματικό βάρος δεν ήταν διαφορετικό από εκείνο των μαρτύρων. Η μακροσκοπική νεκροψία έδειξε μορφολογικές αλλαγές στο λεπτό έντερο των αρσενικών και θηλυκών επίμυων της υψηλής δόσης. Οι βιοχημικές παράμετροι που σχετίζονται με ηπατική βλάβη δεν παρουσίασαν αύξηση ούτε στους αρσενικούς ούτε στους θηλυκούς επίμυες, γεγονός που υποδηλώνει απουσία ηπατικής βλάβης. Η ιστολογική εξέταση του ήπατος στις ομάδες υψηλής δόσης δεν ανέδειξε σημαντικές αλλοιώσεις στους αρσενικούς επίμυες, ενώ παρατηρήθηκαν περιορισμένες διηθήσεις από μονοπύρηνα κύτταρα σε 7/10 θηλυκούς επίμυες, υποδηλώνοντας ελάχιστη, σχετιζόμενη με τη θεραπεία, φλεγμονή στο ήπαρ. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης στο ήπαρ των ομάδων υψηλής δόσης δεν ανέδειξε σημαντικές μεταβολές στα ένζυμα του κυτοχρώματος P450, με εξαίρεση τη σημαντική επαγωγή της έκφρασης του Cyp3a3 και στα δύο φύλα. Ωστόσο, η συνάφεια του ευρήματος αυτού για τον άνθρωπο δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Δεν παρατηρήθηκε επαγωγή ενζύμων P450 που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση προκαρκινογόνων ουσιών. Συνολικά, η υποχρόνια χορήγηση ΜΧ σε επίμυες Wistar έως τη δόση των 400 mg/kg σωματικού βάρους δεν παρουσίασε ενδείξεις τοξικότητας ή επιδράσεων στο ήπαρ. Η συγκεκριμένη δόση αντιστοιχεί σε ημερήσια κατανάλωση περίπου 24 g ΜΧ στον άνθρωπο για 90 ημέρες, ποσότητα τουλάχιστον 10 φορές υψηλότερη από τη συνιστώμενη δόση των 1–2 g για 15 ημέρες ως παραδοσιακό φυτικό φαρμακευτικό προϊόν. Συνολικά, η MX δεν παρουσίασε οξεία τοξικότητα ούτε in vivo γονοτοξικότητα στην οριακή δόση και ήταν γενικά καλά ανεκτή κατά τη διάρκεια 90 ημερών, με ελάχιστα ευρήματα, κυρίως προσαρμοστικού ή παροδικού χαρακτήρα, τα οποία περιορίστηκαν κυρίως στην υψηλότερη δόση.