Μελέτη της ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων σηματοδοτικών μονοπατιών από μη κωδικά μόρια RNA (ncRNA), σε καρκινικά κύτταρα μαστού

Abstract

Breast cancer is characterized by high mortality and dysregulation of critical signaling pathways. Non-coding RNAs (ncRNAs), including large and small non-coding RNAs (sncRNAs), participate in post-transcriptional regulation through mechanisms such as RNA silencing, where miRNAs lead to mRNA degradation or suppression of mRNA translation via the RISC complex. Other sncRNAs exhibit similar regulatory activity, with relatively few molecules having been studied regarding their effect on breast cancer and cellular signaling. In this thesis, cell lines of different breast cancer molecular subtypes were used and treated with proteasome inhibitors to modulate signaling pathways. This was done to investigate specific and universal regulatory mechanisms among the molecular subtypes. Furthermore, the proteasome inhibitors used are being tested in clinical trials primarily for the treatment of advanced breast cancer, while they induce apoptosis through various pathways such as JNK and NFκB. Initially, the effect of inhibitors on the expression of miRNAs with a literature-confirmed role in cancer was studied. This analysis revealed significant heterogeneity among different molecular subtypes and time points. Specifically, miRNAs such as miR-1-3p, miR-421-3p, and miR-765-3p showed decreased levels at various time points, with the analysis of predicted targets demonstrating their significant impact on signaling pathways. Although these miRNAs have some already known roles, the universality of the changes in their levels suggests a potential significant regulatory role in breast cancer cell signaling. Numerous other miRNAs were found to have significant differences in their levels between cell lines belonging to different molecular subtypes. A combined sequencing approach was then performed, integrating sncRNA and poly(A)-RNA sequencing data. Numerous sncRNAs with unique or universal differences in their levels were observed across the conditions studied, with numerous regulatory interactions predicted in each molecular subtype, including less-studied categories of sncRNAs, such as tRNA-derived RNA fragments and piRNAs. The miR-489-3p and miR-876-3p showed consistently reduced expression, and miR-1827 showed increased expression across all conditions studied, while other miRNAs appeared to vary more specifically by molecular subtype. For several piRNAs, including piR-36318 and piR-39245, a significant difference in their levels was observed after treatment with inhibitors in a cell line. Regarding tRNA-derived RNA fragments, numerous molecules, including 5’-tRF-TRN-GTT11, 3’-tRF-TRQ-CTG3, and 5’-tRF-TRV-CAC14, stood out for their potential contribution to cellular signaling. In the next step, the role of miR-22-5p and miR-22-3p was further investigated; these were found to be significantly upregulated, with predicted targets downregulated in a triple-negative breast cancer cell line. Overexpression of miR-22 led to increased levels of the two miRNAs and decreased levels of their predicted mRNA targets, with the targets of miR-22-5p, INSR, ITGB8, and PIK3R1, which are key effectors of the PI3K/AKT pathway, being confirmed via the luciferase assay. Furthermore, the overexpression of miR-22 in the MDA-MB-468 cell line led to a reduction in cell proliferation and migration, suggesting its involvement in critical signaling pathways, while the levels of the abovementioned miRNAs and mRNAs showed a similar change in metastatic triple-negative breast cancer cell lines. Furthermore, another level of post-transcriptional regulation was investigated, involving the reduction of miRNA bioavailability by circular RNAs (circRNAs), with a potential impact on cell signaling. Through a combination of third- and next-generation sequencing technologies, 106 circRNAs of the BAX gene were identified, 82 of which were novel. These molecules exhibited significant structural diversity, such as shorter exon ends, the retention of introns, and the identification of single-exon transcripts. Their expression appeared to vary among molecular subtypes, while circRNAs with nearly universal expression or specific expression in a non-cancerous breast cell line were also identified. Numerous circRNAs are predicted to bind to miRNAs, such as miR-152-5p, indirectly regulating gene expression. Through these interactions, critical signaling pathways are affected, including MAPK, PI3K/AKT, and NFκB, supporting the existence of competing endogenous RNA (ceRNA) networks that regulate apoptosis via BAX. Furthermore, the presence of binding sites for RNA-binding proteins (RNA-binding proteins, RBPs), as well as the existence of competing binding sites for RBPs and miRNAs, suggests that the identified circRNAs participate in complex RNA-protein networks, enhancing their regulatory complexity. This study, using a combination of in-vitro and in-silico experimental approaches, identifies key molecules belonging to different RNA categories that, through multilevel interactions, are predicted to influence gene expression in breast cancer and regulate key signaling pathways.

Ο καρκίνος του μαστού χαρακτηρίζεται από υψηλή θνησιμότητα και απορρύθμιση κρίσιμων σηματοδοτικών οδών. Τα μη κωδικά RNA (non-coding RNAs, ncRNAs), όπως τα μεγάλα και μικρά ncRNAs (small non-coding RNAs, sncRNAs), συμμετέχουν στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση μέσω μηχανισμών όπως η αποσιώπηση του RNA, όπου miRNAs οδηγούν σε αποικοδόμηση ή καταστολή της μετάφρασης mRNAs μέσω του συμπλόκου RISC. Άλλα sncRNAs διαθέτουν παρόμοια ρυθμιστική δράση, με σχετικά λίγα μόρια να έχουν μελετηθεί όσον αφορά την επίδραση τους στον καρκίνο του μαστού και την κυτταρική σηματοδότηση. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές διαφορετικών μοριακών υποτύπων καρκίνου του μαστού στις οποίες πραγματοποιήθηκε επίδραση με αναστολείς του πρωτεασώματος για την μεταβολή σηματοδοτικών οδών. Αυτό πραγματοποιήθηκε με στόχο τη διερεύνηση ειδικών και καθολικών ρυθμιστικών μηχανισμών ανάμεσα στους μοριακούς υποτύπους. Ακόμη, οι αναστολείς του πρωτεασώματος που χρησιμοποιήθηκαν δοκιμάζονται σε κλινικές μελέτες κυρίως για την θεραπεία προχωρημένου καρκίνου του μαστού, ενώ ενεργοποιούν την απόπτωση μέσω διάφορων οδών όπως οι JNK και NFκΒ. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση των αναστολέων στην έκφραση miRNAs με βιβλιογραφικά επιβεβαιωμένο ρόλο στον καρκίνο. Η ανάλυση αυτή κατέδειξε την έντονη ετερογένεια μεταξύ διαφορετικών μοριακών υποτύπων και χρονικών σημείων. Συγκεκριμένα, miRNAs όπως τα miR-1-3p, miR-421-3p και miR-765-3p εμφάνισαν μείωση των επιπέδων τους σε διάφορα χρονικά σημεία με την ανάλυση των προβλεπόμενων στόχων να καταδεικνύει την σημαντική επίδραση τους σε σηματοδοτικές οδούς. Παρότι αυτά τα miRNAs έχουν κάποιο ήδη γνωστό ρόλο, η καθολικότητα στην αλλαγή των επιπέδων τους προτείνει μια ενδεχόμενη σημαντική ρύθμιση στην κυτταρική σηματοδότηση στον καρκίνο του μαστού. Πολυάριθμα, άλλα miRNAs βρέθηκαν με σημαντικές διαφορές στα επίπεδα τους ανάμεσα στις κυτταρικές σειρές που ανήκουν σε διαφορετικούς μοριακούς υποτύπους. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μία συνδυαστική προσέγγιση αλληλούχησης, ενσωματώνοντας δεδομένα αλληλούχησης sncRNA και poly(A)-RNA. Παρατηρήθηκαν sncRNAs με μοναδική ή καθολική διαφορά στα επίπεδα τους ανάμεσα στις καταστάσεις που μελετήθηκαν με πολυάριθμες ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις να προβλέπονται σε κάθε μοριακό υπότυπο, συμπεριλαμβανομένων λιγότερο μελετημένων κατηγοριών sncRNAs, όπως τα θραύσματα που προέρχονται από tRNA και τα piRNAs. Tα miR-489-3p και miR-876-3p παρουσίασαν σταθερά μειωμένη έκφραση και το miR-1827 αυξημένη έκφραση μεταξύ όλων των καταστάσεων που μελετήθηκαν, ενώ άλλα miRNAs φάνηκε να μεταβάλλονται πιο ειδικά ανά μοριακό υπότυπο. Για αρκετά piRNAs συμπεριλαμβανομένων των piR-36318 και piR-39245 παρουσιάστηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα τους υπό την επίδραση με τους αναστολείς σε μια κυτταρική σειρά. Όσον αφορά τα θραύσματα μεταφορικού RNA πολυάριθμα μόρια συμπεριλαμβανομένων των 5’-tRF-TRN-GTT11, 3’-tRF-TRQ-CTG3, και 5’-tRF-TRV-CAC14 ξεχώρισαν με πιθανή συμβολή τους στην κυτταρική σηματοδότηση. Σε επόμενο στάδιο, διερευνήθηκε περαιτέρω ο ρόλος των miR-22-5p και miR-22-3p, τα οποία βρέθηκαν να αυξάνονται σημαντικά, με προβλεπόμενους στόχους να μειώνονται στην κυτταρική σειρά τριπλά αρνητικού καρκίνου του μαστού. Η υπερέκφραση του miR-22 οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων των δύο miRNAs και μείωση των προβλεπόμενων mRNA στόχων, με τους στόχους του miR-22-5p, INSR, ITGB8 και PIK3R1, οι οποίοι είναι βασικοί τελεστές της οδού PI3K/AKT, να επιβεβαιώνονται και μέσω της δοκιμασίας μέτρησης της ενεργότητας της λουσιφεράσης. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-22 στη σειρά MDA-MB-468 οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης, υποδηλώνοντας την εμπλοκή του σε κρίσιμες σηματοδοτικές οδούς, ενώ τα επίπεδα των miRNAs και mRNAs στόχων παρουσίασαν παρόμοια μεταβολή σε σειρές τριπλά αρνητικά καρκίνου του μαστού μεταστατικής προέλευσης.Ακόμη, διερευνήθηκε ένα άλλο επίπεδο μετα-μεταγραφικής ρύθμισης το οποίο περιλαμβάνει την μείωση της βιοδιαθεσιμότητας των miRNAs από κυκλικά μόρια RNA (circRNAs) με πιθανή επίδραση στην κυτταρική σηματοδότηση. Μέσω συνδυασμού τεχνολογιών αλληλούχησης τρίτης και επόμενης γενιάς, ταυτοποιήθηκαν 106 circRNAs, του γονιδίου BAX εκ των οποίων 82 νέα. Τα μόρια αυτά παρουσίασαν σημαντική δομική ποικιλομορφία, όπως τα κοντύτερα άκρα εξωνίων η διατήρηση εσωνίων, αλλά και η εύρεση μονοεξωνιακών μεταγράφων. Η έκφραση τους φάνηκε να είναι διαφοροποιημένη ανάμεσα στους μοριακούς υποτύπους ενώ ταυτοποιήθηκαν και circRNAs με σχεδόν καθολική έκφραση ή ειδική έκφραση σε μη καρκινική κυτταρική σειρά μαστού. Πολυάριθμα circRNAs προβλέπεται να δεσμεύουν miRNAs, όπως το miR-152-5p ρυθμίζοντας έμμεσα τη γονιδιακή έκφραση. Μέσω αυτών των αλληλεπιδράσεων επηρεάζονται κρίσιμα σηματοδοτικά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένων των MAPK, PI3K/AKT και NFκB, υποστηρίζοντας την ύπαρξη ενδογενών ανταγωνιστικών RNA (competing endogenous RNA, ceRNA) δικτύων που ρυθμίζουν την απόπτωση μέσω του BAX. Επιπλέον, η παρουσία θέσεων δέσμευσης για πρωτεΐνες που δεσμεύονται στο RNA (RNA binding proteins, RBPs), αλλά και η ύπαρξη ανταγωνιστικών θέσεων δέσμευσης RBPs και miRNAs υποδηλώνει ότι αυτά τα circRNAs συμμετέχουν σε σύνθετα δίκτυα RNA-πρωτεϊνών, ενισχύοντας τη ρυθμιστική τους πολυπλοκότητα. Η παρούσα μελέτη, με τον συνδυασμό in-vitro και in-silico πειραματικών προσεγγίσεων, αναδεικνύει σημαντικούς τελεστές που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες RNA και μέσω πολυεπίπεδων αλληλεπιδράσεων προβλέπεται να επιδρούν στην γονιδιακή έκφραση στον καρκίνο του μαστού διαμορφώνοντας βασικές σηματοδοτικές οδούς.