Characterisation of cytoplasmic lncRNA interactions with translation machinery during human neuronal differentiation

Abstract

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are non-coding transcripts longer than 200nt, many of which are capped, spliced and polyadenylated, like mRNAs. However, lncRNAs exhibit more tissue and developmental-stage specificity than mRNAs andare particularly enriched in the nervous system. Several lncRNAs contribute toneuronal differentiation and lncRNA mis-regulation is implicated in neurologicaldisorders. Whilst nuclear functions of lncRNAs are extensively studied, less is knownabout their cytoplasmic functions, even though many are localised there. LncRNAscontain small Open Reading Frames (smORFs) a small proportion of which showevidence of active translation, resulting in small peptide synthesis in S. cerevisiae, D.melanogaster, M. musculus and H. sapiens. However, these translation events remainpoorly understood. This thesis aims to characterise the interactions of cytoplasmiclncRNAs with the translation machinery and investigate their coding potential, usingPoly-Ribo-Seq, during the early stages of human neuronal differentiation. Differentiation of human SH-SY5Y cells with retinoic acid resulted in asignificant reduction of active translation, revealed by polysome profiling. To determinethe importance of lncRNA-polysome interactions in differentiation, Poly-Ribo-Seq wasperformed in undifferentiated and differentiated SH-SY5Y. Upon neuronaldifferentiation 178 lncRNAs are upregulated and 100 downregulated, 71% and 58%of which are associated with polysomes, respectively. Additionally, a dynamicinteraction pattern between lncRNAs and polysomes was identified duringdifferentiation, validated by RT-qPCR of specific cytoplasmically enriched lncRNAsacross sucrose gradients.LncRNAs of Control and differentiated cells contain actively translatedsmORFs. 45 translated lncRNA smORFs were identified by Poly-Ribo-Seq. One ofthese is LINC01116 smORF, encoding for an 87aa putative peptide. Its translationwas validated by FLAG-tagging assays in SH-SY5Y and HEK293 cells. It exhibitscytoplasmic distribution with distinct localisation in cell membrane protrusions.LINC01116 expression is upregulated 4-fold upon differentiation. LINC01116knockdown results in significant reduction of neurite length and neuronal markerMOXD1 in differentiated cells indicating it contributes to neuronal differentiation.

Τα μακρά μη κωδικά RNA (lncRNAs) είναι μη κωδικά μετάγραφα με μήκος μεγαλύτερο από 200 νουκλεοτίδια, πολλά από τα οποία φέρουν κάλυμμα 5', υφίστανται συρραφή (splicing) και πολυαδενυλίωση, όπως τα mRNA. Ωστόσο, τα lncRNAs εμφανίζουν μεγαλύτερη ειδικότητα ως προς τον ιστό και το αναπτυξιακό στάδιο από τα mRNA και είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα στο νευρικό σύστημα. Αρκετά lncRNAs συμβάλλουν στη νευρωνική διαφοροποίηση και η απορρύθμισή τους έχει συσχετιστεί με νευρολογικές διαταραχές. Παρότι οι πυρηνικές λειτουργίες των lncRNAs έχουν μελετηθεί εκτενώς, γνωρίζουμε πολύ λιγότερα για τις κυτταροπλασματικές λειτουργίες τους. Τα lncRNAs περιέχουν μικρά ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (small open reading frames -smORFs), για ένα μικρό ποσοστό των οποίων υπάρχουν ενδείξεις ενεργού μετάφρασης, με αποτέλεσμα τη σύνθεση μικρών πεπτιδίων σε S. cerevisiae, D. melanogaster, M. musculus και H. sapiens. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ελέγχουν αυτά τα μεταφραστικά γεγονότα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Η παρούσα διατριβή στοχεύει στο να χαρακτηρίσει τις αλληλεπιδράσεις των κυτταροπλασματικών lncRNAs με το μηχανισμό της μετάφρασης και να διερευνήσει το δυναμικό αυτών των lncRNAs στο να κωδικοποιούν πρωτεΐνες κατά τα πρώτα στάδια της ανθρώπινης νευρωνικής διαφοροποίησης, χρησιμοποιώντας Poly-Ribo-Seq. Η διαφοροποίηση των ανθρώπινων κυττάρων νευροβλαστώματος (SH-SY5Y) με ρετινοϊκό οξύ οδήγησε σε σημαντική μείωση της ενεργού μετάφρασης, όπως αποκαλύφθηκε μετά από ανάλυση πολυσωμάτων (polysome profiling). Για να προσδιοριστεί η σημασία των αλληλεπιδράσεων lncRNA-πολυσωμάτων κατά τη διαφοροποίηση, πραγματοποιήθηκε Poly-Ribo-Seq σε αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα SH-SY5Y. Κατά τη νευρωνική διαφοροποίηση, 178 lncRNAs έδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση της μεταγραφής τους και 100 έδειξαν στατιστικά σημαντική μείωση της μεταγραφής, εκ των οποίων το 71% και το 58% αντίστοιχα βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με πολυσώματα. Επιπλέον, εντοπίστηκε ένα δυναμικό μοτίβο αλληλεπίδρασης μεταξύ lncRNAs και πολυσωμάτων κατά τη διαφοροποίηση, το οποίο επιβεβαιώθηκε με RT-qPCR συγκεκριμένων κυτταροπλασματικά εμπλουτισμένων lncRNAs μετά από απομόνωση με κλίση σουκρόζης. Τα lncRNAs των αδιαφοροποίητων και των διαφοροποιημένων κυττάρων περιέχουν smORFs που μεταφράζονται ενεργά. Με την εφαρμογή του Poly-Ribo-Seq ταυτοποιήθηκαν 45 lncRNAs που περιέχουν μεταφραζόμενα smORFs. Ένα από αυτά είναι το smORF του LINC01116, το οποίο κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο 87 αμινοξέων. Η μετάφρασή του επιβεβαιώθηκε με επισήμανση με FLAG tag σε κύτταρα SH-SY5Y και HEK293. Το πεπτίδιο που προκύπτει από τη μετάφραση του LINC01116 παρουσιάζει κυτταροπλασματική κατανομή με διακριτό εντοπισμό σε προεκβολές της κυτταρικής μεμβράνης. Η έκφραση του LINC01116 αυξάνεται 4 φορές μετά τη διαφοροποίηση. Η αποσιώπηση του LINC01116 οδηγεί σε σημαντική μείωση του μήκους των νευριτών και του νευρωνικού δείκτη MOXD1 στα διαφοροποιημένα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι συμβάλλει στη νευρωνική διαφοροποίηση.