Μοριακός χαρακτηρισμός και μελέτη in vitro δραστικότητας αντιμικροβιακών έναντι εντεροβακτηριακών που παράγουν καρβαπενεμάσες

Abstract

K.pneumoniae has emerged as a major clinical and public health threat. Klebsiella pneumoniae bacteremia is responsible for reduced life expectancy, increased rates of treatment failure worldwide and increased healthcare spending. The management of K.pneumoniae infections has become challenging due to the emerging antimicrobial resistance. Of special concern is the rise of carbapenem-resistant isolates. Within the European countries, carbapenem-resistant K.pneumoniae are most widespread in the Mediterranean Region with a prevalence of approximately 60% in Greece. Resistance to carbapenems in K.pneumoniae involves multiple mechanisms, including the production of carbapenemases (e.g., KPC, NDM, VIM, OXA-48) and alterations in outer membrane permeability (mutation or loss of porins and upregulation of efflux systems). The rapid dissemination of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae is driven by several successful clones worldwide. Antibiotics active against carbapenem-resistant (CR) K. pneumoniae strains are diminishing at an alarming rate. Therefore, until recently, older antibiotics with high toxicity, such as colistin, fosfomycin, tigecycline and aminoglycosides, were employed. Fortunately, a variety of new drugs have been developed in recent years against MDR gram-negative infections. We aimed to investigate the CRKP clonal lineages, their antibiotic resistance determinants, and their potential transmissions in a tertiary care hospital located in Athens, Greece. A total of 586 non-duplicate carbapenem-resistant K.pneumoniae strains were collected from a tertiary hospital in Greece from 10/2003-12/2021. They originated exclusively from blood cultures. Antimicrobial susceptibility testing was performed and carbapenemase genes were detected. Overall, the carbapenemases produced included KPC (65.87%, n=386/586), NDM (10.75%, n=63/586), VIM (16.38%, n=96/586), OXA-48 carbapenemases (1.71%, n=10/586). Simultaneous detection of two carbapenemase genes was found in 5.29% (n=31/586) isolates: blaKPC/ blaVIM (4.78%, n=28/586), blaKPC/ blaNDM (0.17%, n=1/586), blaNDM/ blaVIM (0.17%, n=1/586) and blaNDM/ blaOXA-48 (0.17%, n=1/586). The most prevalent carbapenemase gene was blaKPC, followed by VIM. Among KPC strains, KPC-2 was the predominant KPC carbapenemase, followed by KPC-3. The blaKPC-23 gene was detected in 3 K.pneumoniae KPC isolates. The investigated carbapenem-resistant K.pneumoniae strains were resistant to amynoglycosides at a percentage ranging from 45.56% to 95.05% (with gentamicin harboring the lowest rate of resistance and tobramycin the highest) and almost all were resistant to fluoroquinolones (95.90%) and cotrimoxazole (89,76%). 36.01% of the carbapenem-resistant strains were resistant to colistin and 32.42% exhibited MIC tigecycline above 1mg/l. Ceftazidime-avibactam was proven highly efficient in vitro against blaKPC and blaOXA-48 positive strais, with only 2 KPC strains recorded as resistant. It is worth mentioning that we recorded 58 strains with intermediate MIC meropenem (4 mg/L ≤ MIC≤ 8 mg/L) and 10 strains with MIC meropenem ≤ 2 mg/L. Whole genome sequencing (WGS) was performed on the Illumina platform to characterize 209 of these isolates. 74% (n=155) of 209 isolates belonged to three major clonal lineages; ST258 (n=108), ST147 (n=29), and ST11 (n=18). Acquired carbapenemase genes were the mechanisms of resistance in 205 isolates (blaKPC, n=123; blaVIM, n=56; blaNDM, n=20; blaOXA-48, n=6). Strong associations (p=0.0004) were observed between carbapenemase genes and clonal lineages. BlaVIM-1-carrying ST147 strains were first isolated during the early sampling period in 2003, followed by the emergence of blaKPC-2-carrying ST258 in 2006, and blaNDM-1-carrying ST11 in 2013. Analysis of genetic distances between the isolates revealed six potential transmission events. Acquisition of multiple carbapenemase genes by Klebsiella pneumoniae (Kp) is also an emerging public health threat. We tried to elucidate the population structure of Kp blood isolates carrying two different carbapenemase genes and identify the mechanism facilitating their dissemination. The study was conducted between 2014 and 2022. Twenty-four patients with bacteremia caused by Kp carrying two different carbapenemase genes were identified. All 24 blood isolates were analyzed by short-read genome sequences supplemented by long reads in a selected number of isolates. All isolates carried blaKPC (23 blaKPC-2, 1 blaKPC-3) and blaVIM-1 genes, along with a variety of antimicrobial resistance determinants. The isolates were clustered in six clonal lineages (ST39, ST147, ST323, ST258, ST3035, and ST340). Long-read genome sequences demonstrated that each carbapenemase gene was located in a separate group of plasmids: the blaKPC-2 on a fusion of IncFIB(pQil) and IncFII(K) plasmids, the blaKPC-3 on IncX3, the blaVIM-1 on IncC, or a fusion of the IncFIB(pNDM-Mar) and IncHI1B(pNDM-MAR) plasmids. Comparison of plasmid content of eight isolates carrying a single carbapenemase gene with eight isolates carrying two carbapenemase genes, matched by clonal lineages, revealed that the second carbapenemase gene was acquired by addition of another plasmid. Identical plasmids were found within the same lineage and across lineages. These findings suggest that dissemination of carbapenemase genes in our hospital setting was driven by multiple plasmids across a variety of highly efficient clones.In conclusion, the current study highlighted the high rates of resistance of CRKPs in older antibiotics, identified the underlying resistance genes, and described their relative frequency and evolution over time. Through genome sequencing, the corresponding clones (sequence types) were identified and correlated with the various carbapenemase genes. These genes were mapped on plasmids and these data were used to document intra-hospital dissemination events of the above clones. Applying the methodology of the current study on a larger scale will probably provide important data for a better understanding of the dispersion of CRKP strains in Greece, helping thus to control it.

H K.pneumoniae έχει αναδειχθεί σε σημαντική απειλή για τη δημόσια υγεία. Η βακτηριαιμία από Klebsiella pneumoniae ευθύνεται για μείωση του προσδόκιμου ζωής, αυξημένα ποσοστά θεραπευτικής αποτυχίας παγκοσμίως και αυξημένες δαπάνες υγειονομικής περίθαλψης. Η διαχείριση των λοιμώξεων από K.pneumoniae έχει καταστεί δυσχερής λόγω αναδυόμενης αντοχής στα αντιμικροβιακά φάρμακα. Ιδιαίτερη ανησυχία προκαλεί η αύξηση των ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών (CR). Στις Ευρωπαϊκές χώρες, η CR K.pneumoniae είναι πιο διαδεδομένη στην περιοχή της Μεσογείου με επιπολασμό περίπου 60% στην Ελλάδα. Η αντοχή στις καρβαπενέμες στην K.pneumoniae οφείλεται σε πολλαπλούς μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής καρβαπενεμασών (π.χ., KPC, NDM, VIM, OXA-48) και των μεταβολών στη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης (μετάλλαξη ή απώλεια πορινών και επαγωγή αντλιών εκροής). Η ταχεία διασπορά της CR Klebsiella pneumoniae οφείλεται σε κυκλοφορούντες κλώνους παγκοσμίως. Οι θεραπευτικές επιλογές για την αντιμετώπιση στελεχών CR K.pneumoniae μειώνονται με ανησυχητικό ρυθμό. Μέχρι σχετικά πρόσφατα, χρησιμοποιούνταν αντιβιοτικά, είτε παλαιότερα ή με υψηλή τοξικότητα, όπως η κολιστίνη, η φωσφομυκίνη, και οι αμινογλυκοσίδες. Ευτυχώς, τα τελευταία χρόνια έχει αναπτυχθεί μια ποικιλία νέων φαρμάκων κατά των λοιμώξεων από πολυανθεκτικά Gram αρνητικά μικρόβια. Στόχος της διατριβής είναι να περιγραφούν τα μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των CPKP από αιμοκαλλιέργειες ασθενών του νοσοκομείου μας, να αναλυθούν τα γονίδια αντοχής σε αντιμικροβιακά και οι κυκλοφορούντες κλώνοι, να παρουσιάσουμε τα δεδομένα σχετικά με τα ποσοστά αντοχής σε παλαιότερα και νεότερα αντιμικροβιακά και τέλος να διερευνήσουμε πιθανά συμβάντα μεταδόσεως σε ενδονοσοκομειακό επίπεδο. Συνολικά 586 μοναδικά στελέχη CRKP συλλέχθηκαν από ένα τριτοβάθμιο νοσοκομείο στην Ελλάδα από 10/2003 έως 12/2021. Προέρχονταν αποκλειστικά από καλλιέργειες αίματος. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά και ανιχνεύθηκαν γονίδια καρβαπενεμάσης. Συνολικά, οι καρβαπενεμάσες που παράχθηκαν περιελάμβαναν KPC (65,87%, n=386/586), NDM (10,75%, n=63/586), VIM (16,38%, n=96/586) και OXA-48 (1,71%, n=10/586). Ταυτόχρονη ανίχνευση δύο γονιδίων καρβαπενεμάσης βρέθηκε σε 5,29% (n=31/586) των στελεχών που απομονώθηκαν: blaKPC/blaVIM (4,78%, n=28/586), blaKPC/blaNDM (0,17%, n=1/586), blaNDM/blaVIM (0,17%, n=1/586) και blaNDM/blaOXA-48 (0,17%, n=1/586).Το πιο διαδεδομένο γονίδιο καρβαπενεμάσης ήταν το blaKPC, ακολουθούμενο από το VIM. Μεταξύ των γονιδίων KPC, το KPC-2 ήταν το κυρίαρχο γονίδιο καρβαπενεμάσης KPC, ακολουθούμενο από την KPC-3. Το γονίδιο blaKPC-23 ανιχνεύθηκε σε 3 απομονωμένα στελέχη KPC του στελέχους K.pneumoniae.Τα εξεταζόμενα στελέχη K.pneumoniae ήταν ανθεκτικά στις αμινογλυκοσίδες σε ποσοστό που κυμαινόταν από 45,56% έως 95,05% (με τη γενταμικίνη να παρουσιάζει το χαμηλότερο ποσοστό αντοχής και την τομπραμυκίνη το υψηλότερο) και ήταν σχεδόν όλα ανθεκτικά στις φθοροκινολόνες (95,90%) και την κοτριμοξαζόλη (89,76%). Το 36,01% των στελεχών ανθεκτικών στις καρβαπενέμες ήταν ανθεκτικά στην κολιστίνη και το 32,42% εμφάνισε MIC τιγκεκυκλίνης άνω του 1mg/l. Η κεφταζιδίμη-αβιμπακτάμη αποδείχθηκε ιδιαίτερα αποτελεσματική in vitro έναντι των στελεχών blaKPC και blaOXA-48 στελεχών, με μόνο 2 στελέχη KPC να καταγράφονται ως ανθεκτικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι καταγράψαμε 58 στελέχη με ενδιάμεση MIC μεροπενέμης (4 mg/L ≤ MIC≤ 8 mg/L) και 10 στελέχη με MIC μεροπενέμης ≤ 2 mg/L.Μεταξύ 2003 και 2018, απομονώθηκαν 392 στελέχη CRKP από βακτηριαιμίες σε νοσηλευόμενους ασθενείς. Σε 209 από αυτά τα στελέχη πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση γονιδιώματος (WGS) για τον χαρακτηρισμό τους. Το 74% (n=155) από τα 209 απομονωμένα στελέχη ανήκε σε τρεις κύριους κλώνους: ST258 (n=108), ST147 (n=29) και ST11 (n=18). Παρατηρήθηκαν ισχυρές συσχετίσεις (p=0,0004) μεταξύ των γονιδίων καρβαπενεμάσης και των κλώνων. Τα στελέχη ST147 που φέρουν blaVIM-1 απομονώθηκαν για πρώτη φορά κατά την πρώιμη περίοδο δειγματοληψίας το 2003, ακολουθούμενα από την εμφάνιση των ST258 στελεχών που φέρουν blaKPC-2 το 2006 και των ST11 στελεχών που φέρουν blaNDM-1 το 2013. Η ανάλυση των γενετικών αποστάσεων μεταξύ των απομονωμένων στελεχών αποκάλυψε έξι πιθανά συμβάντα ενδονοσοκομειακής μετάδοσης. Η απόκτηση πολλαπλών γονιδίων καρβαπενεμάσης από την Klebsiella pneumoniae (Kp) αποτελεί επίσης μια αναδυόμενη απειλή. Προσπαθήσαμε να διευκρινίσουμε τη δομή του πληθυσμού των στελεχών Kp που φέρουν δύο διαφορετικά γονίδια καρβαπενεμάσης και να εντοπίσουμε τον μηχανισμό που διευκολύνει τη διασπορά τους. Για το μέρος αυτό της μελέτης ταυτοποιήθηκαν είκοσι τέσσερις ασθενείς, μεταξύ 2014 και 2022, με βακτηριαιμία που προκλήθηκε από Kp που έφεραν δύο διαφορετικά γονίδια καρβαπενεμάσης. Και τα 24 απομονωθέντα στελέχη αναλύθηκαν με αλληλουχίες γονιδιώματος βραχείας ανάγνωσης. Αλληλούχιση γονιδιώματος μακράς ανάγνωσης πραγματοποιήθηκε σε έναν επιλεγμένο αριθμό στελεχών. Όλα τα στελέχη έφεραν τα γονίδια blaKPC (23 blaKPC-2, 1 blaKPC-3) και blaVIM-1, μαζί με μια ποικιλία παραγόντων αντοχής στα αντιμικροβιακά. Τα στελέχη ομαδοποιήθηκαν σε έξι κλώνους (ST39, ST147, ST323, ST258, ST3035 και ST340). Οι αλληλουχίες γονιδιώματος μακράς ανάγνωσης έδειξαν ότι κάθε γονίδιο καρβαπενεμάσης βρισκόταν σε ξεχωριστή ομάδα πλασμιδίων: το blaKPC-2 σε μια σύντηξη πλασμιδίων IncFIB(pQil) και IncFII(K), το blaKPC-3 στο IncX3, το blaVIM-1 στο IncC ή σε μια σύντηξη των πλασμιδίων IncFIB(pNDM-Mar) και IncHI1B(pNDM-MAR). Η σύγκριση της περιεκτικότητας σε πλασμίδια οκτώ στελεχών που φέρουν ένα μόνο γονίδιο καρβαπενεμάσης με οκτώ στελέχη που φέρουν δύο γονίδια καρβαπενεμάσης, τα οποία αντιστοιχούν σε ίδιους κλώνους, αποκάλυψε ότι το δεύτερο γονίδιο καρβαπενεμάσης αποκτήθηκε με την προσθήκη ενός άλλου πλασμιδίου. Πανομοιότυπα πλασμίδια βρέθηκαν εντός του ίδιου κλώνου και μεταξύ των κλώνων. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η διασπορά των γονιδίων καρβαπενεμάσης στο νοσοκομειακό μας περιβάλλον καθοδηγήθηκε από πολλαπλά πλασμίδια σε μια ποικιλία εξαιρετικά αποτελεσματικών κλώνων. Συμπερασματικά, η τρέχουσα μελέτη ανέδειξε τα υψηλά ποσοστά αντοχής των CRKP στα παλαιότερα αντιβιοτικά, ταυτοποίησε τα υποκείμενα γονίδια αντοχής και περιέγραψε τη σχετική τους συχνότητα και τη διαχρονική εξέλιξή τους. Μέσω αλληλούχισης γονιδιώματος ταυτοποιήθηκαν οι αντίστοιχοι κλώνοι και συσχετίσθηκαν με τα διάφορα γονίδια καρβαπενεμασών. Τα γονίδια αυτά χαρτογραφήθηκαν πλασμιδιακά και τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την τεκμηρίωση ενδονοσοκομειακής διασποράς των παραπάνω κλώνων. Η εφαρμογή της μεθοδολογίας της τρέχουσας μελέτης σε μεγαλύτερη κλίμακα θα μπορέσει να προσφέρει σημαντικά δεδομένα για την καλύτερη κατανόηση της διασποράς των στελεχών CRKP, τα οποία μπορεί να χρησιμοποιηθούν για τον περιορισμό και την αντιμετώπισή της.