Μελέτη των βιολογικών επιδράσεων της ουσίας Tetraglyme σε υδρόβιους οργανισμούς και σε in vitro πειραματικά μοντέλα

Abstract

Tetraglyme is a polar aprotic solvent of the glycol ether family, and its extensive industrial use enhances its environmental presence. The latter, combined with the compound’s persistent and highly stable chemical profile, raises concerns regarding its potential adverse effects on both aquatic organisms and human health. In this context, the present dissertation thesis aimed to provide the first comprehensive assessment of the potential effects of Tetraglyme on aquatic organisms and in vitro biological models, aiming to generate useful data and conclusions regarding the substance’s hazard potential and its proper management. Initially, chemical characterization of aqueous solutions of the compound was performed using 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) and UHPLC-MS (Ultra-High Performance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) to assess its stability and investigate the formation of by-products under acidic and alkaline conditions. The results revealed that Tetraglyme, under alkaline conditions (pH ≥ 7) can undergo transformation, leading to the formation of by-products that could potentially affect its biological activity. Subsequently, biological tests were conducted using biological models representing different trophic levels. Specifically, algal bioassays using marine algal species (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis suecica) and freshwater species (Chlorella vulgaris, Chlorococcum sp., and Scenedesmus rubescens), were performed to assess their growth rate and changes in photosynthetic parameters (chlorophyll a and b, carotenoids, chlorophyll fluorescence indices, and electron transport rate) following exposure to Tetraglyme. Moreover, the toxic potential of Tetraglyme was investigated with the use of the crustaceans Thamnocephalus platyurus and Daphnia magna, the rotifer Brachionus calyciflorus (in terms of mortality rates and toxicological endpoints), as well as the bacterium Aliivibrio fischeri through the assessment of bioluminescence inhibition (Microtox system). Interestingly, the study also emphasized the evaluation of Tetraglyme effects on the marine mussel Mytilus galloprovincialis. Specifically, Tetraglyme mediated cellular (Neutral Red Retention Time assay), oxidative (O2•−, NO, MDA, and ROS levels), and genotoxic (in terms of micronucleus frequency/MN) effects were examined in hemolymph/hemocytes of challenged mussels, while transcriptomic analysis was conducted on their gill tissues to identify potential alterations in gene expression and to elucidate molecular processes induced after Tetraglyme exposure. Furthermore, the cytotoxic, cyto-genotoxic, and oxidative effects of Tetraglyme and/or its derivatives were assessed in human lymphocyte cultures using the Cytokinesis Block Micronucleus (CBMN) assay, with and without metabolic activation (S9 mix), while intracellular ROS levels were determined via the DCFH-DA assay. Finally, the potential interaction/binding of Tetraglyme with lysozyme (Hen Egg White Lysozyme/HEWL) was investigated through computational simulations and crystallographic experiments to determine whether the compound could induce structural alterations. According to the results of the present study, Tetraglyme (and possibly its by-products), although generally regarded as a low-hazard compound, can induce moderate biological effects across a wide range of organisms and biological models, at concentrations ranging from μg to mg L-1. Regarding the results obtained from the algal bioassays, Tetraglyme could inhibit cellular growth and induce low to moderate alterations in the photosynthetic apparatus, while also affecting the ability of the cells to adapt to increasing light intensity, particularly at higher Tetraglyme concentrations, thus highlighting the activation of photoprotective mechanisms as a response to environmental stress. The different responses (in terms of sensitivity) among the tested microalgae were also observed in the tested zooplankton species (aquatic invertebrates) and in the bacterium A. fischeri. Specifically, B. calyciflorus was more sensitive to Tetraglyme, whereas D. magna exhibited the highest tolerance. In the case of A. fischeri, inhibition of bioluminescence was recorded, leading to the classification of the compound as harmful based on the calculated EC50 values, suggesting a possible disruption of its metabolism, particularly at higher concentrations, indicating that although Tetraglyme displays low toxicity toward microorganisms, it cannot be considered biologically inert. Additionaly, the present study revealed for the first time that Tetraglyme, even at environmentally relevant concentrations, can induce significant cellular, oxidative, and genotoxic effects in the mussel species Mytilus galloprovincialis, as revealed by the increased levels of O2•−, NO, MDA, and ROS, destabilization of lysosomal membranes, and the higher frequency of MN formation in the hemocytes of challenged mussels. In parallel, the large number of differentially expressed genes (DEGs) identified through transcriptomic analysis of gill tissues revealed extensive molecular disturbances, affecting pathways associated with Tetraglyme metabolism, cell signaling, apoptosis, lysosomal function, and cellular homeostasis. In the case of human lymphocytes, the results indicated that although Tetraglyme and/or its derivatives cannot alter their viability, the increased frequency of micronuclei, the reduction in the proliferation index (specifically in the presence of S9), and the elevated ROS production are indicative of their cyto-genotoxic and oxidative potential. Regarding the Tetraglyme-HEWL system, experimental data (XRPD, SCXRD, and SSX) did not confirm its binding potential (as predicted by computational simulations), and the substance did not induce changes in the protein’s structure or crystal symmetry. In conclusion, the findings of the present study challenge the current classification of Tetraglyme as an environmentally friendly substance, a characterization that has been based mainly on its low volatility and reduced acute toxicity compared to other organic solvents. Our results demonstrate that Tetraglyme can induce targeted cellular and molecular responses, highlighting the need for reconsideration of its environmental risk thus favoring its proper management, environmental protection, and human health.

Η Tetraglyme αποτελεί πολικό απρωτικό διαλύτη της κατηγορίας των αιθέρων γλυκόλης και η ευρεία βιομηχανική χρήση της ενισχύει την περιβαλλοντική της παρουσία. Το παραπάνω, σε συνδυασμό με το ανθεκτικό και ιδιαίτερα σταθερό χημικό προφίλ της ουσίας, εγείρει ανησυχίες για τις δυσμενείς επιπτώσεις τόσο στους υδρόβιους οργανισμούς όσο και στην ανθρώπινη υγεία. Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη έρευνα διερεύνησης των δυνητικών επιπτώσεων της Tetraglyme σε υδρόβιους οργανισμούς και σε in vitro πειραματικά μοντέλα, με απώτερο στόχο την εξαγωγή χρήσιμων δεδομένων και συμπερασμάτων για την επικινδυνότητα της ουσίας και την ορθή διαχείρισή της. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε χημικός χαρακτηρισμός υδατικών διαλυμάτων της ουσίας μέσω των αναλυτικών τεχνικών 1H-NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) και UHPLC-MS (Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry), για τον προσδιορισμό της σταθερότητάς της, καθώς και για τη διερεύνηση του σχηματισμού παραπροϊόντων υπό όξινες και αλκαλικές συνθήκες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η Tetraglyme σε αλκαλικές συνθήκες (pH ≥ 7) μπορεί να μετασχηματιστεί, δημιουργώντας παραπροϊόντα, τα οποία ενδέχεται να επηρεάζουν τη βιολογική της δράση. Στη συνέχεια, ακολούθησαν βιολογικές αναλύσεις/δοκιμές, με τη χρήση βιολογικών μοντέλων από διαφορετικά επίπεδα της τροφικής αλυσίδας. Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε η επίδραση της Tetraglyme (δοκιμές 96h) στην ικανότητα ανάπτυξης, στη φωτοσυνθετική απόδοση και στη φωτοσυνθετική λειτουργία (προσδιορισμός φωτοσυνθετικών χρωστικών, όπως χλωροφύλλες και καροτενοειδή) μικροφυκών γλυκού (Scenedesmus rubescens, Chlorococcum sp., Chlorella vulgaris) και αλμυρού (Dunaliella tertiolecta και Tetraselmis suecica) νερού, οι μεταβολές στους δείκτες φθορισμού, καθώς και η ικανότητα εγκλιματισμού τους σε διακυμάνσεις της ακτινοβολίας. Περαιτέρω δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε υδρόβια ασπόνδυλα (Thamnocephalus platyurus, Brachionus calyciflorus, Daphnia magna), με προσδιορισμό του ποσοστού θνησιμότητας και των αντίστοιχων παραμέτρων, καθώς και στο βακτήριο Aliivibrio fischeri, με προσδιορισμό της αναστολής της βιοφωταύγειας (χρήση του συστήματος Microtox). Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην εκτίμηση των επιπτώσεων της υπό μελέτη ουσίας στο δίθυρο μαλάκιο Mytilus galloprovincialis, τόσο σε επίπεδο οργανισμού (in vivo) όσο και σε απομονωμένα αιμοκύτταρα (in vitro). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η ικανότητα της Tetraglyme να επάγει κυτταροτοξικές επιπτώσεις (τεχνική Neutral Red Retention Time), οξειδωτική καταπόνηση (επίπεδα O2•−, NO, MDA και ROS) και γενοτοξικές βλάβες (συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων/MN) σε ιστούς του είδους (αιμόλεμφος/αιμοκύτταρα), ενώ πραγματοποιήθηκε μεταγραφωματική ανάλυση στα βράγχια των εκτιθέμενων ατόμων, προκειμένου να ανιχνευθούν πιθανές διαφοροποιήσεις στην έκφραση γονιδίων και να κατανοηθούν τυχόν μοριακές διεργασίες που ενεργοποιούνται μετά την έκθεση στην Tetraglyme. Ακόμη, αξιολογήθηκε η κυτταρο-γενοτοξική και οξειδωτική δράση της Tetraglyme και/ή των παραγώγων της σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων, μέσω της μεθόδου προσδιορισμού μικροπυρήνων με αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis-block Micronucleus/CBMN assay), με και χωρίς την προσθήκη εξωγενούς μεταβολικού συστήματος (S9 mix), και προσδιορίστηκε η παραγωγή ενδοκυτταρικών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species/ROS) μέσω της τεχνικής DCFH-DA. Τέλος, διερευνήθηκε, μέσω υπολογιστικών προσομοιώσεων και κρυσταλλογραφικών πειραμάτων, η πιθανότητα πρόσδεσης της Tetraglyme με την πρωτεΐνη λυσοζύμη (Hen Egg White Lysozyme/HEWL), ώστε να διαπιστωθεί αν η υπό μελέτη ουσία είναι ικανή να προκαλέσει αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωσή της. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η Tetraglyme (και πιθανώς τα παραπροϊόντα της), αν και θεωρείται ουσία χαμηλής επικινδυνότητας, μπορεί να προκαλέσει ήπιες βιολογικές επιδράσεις σε ευρύ φάσμα οργανισμών και βιολογικών μοντέλων, οι οποίες εκδηλώνονται σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από μg έως mg L-1. Στην περίπτωση των μικροφυκών, η Tetraglyme μπορεί να προκαλέσει αναστολή της ανάπτυξης, καθώς και μικρού έως μέτριου βαθμού μεταβολές στη φωτοσυνθετική συσκευή τους, τόσο σε επίπεδο απόδοσης του φωτοσυστήματος ΙΙ (PSII) όσο και στην ικανότητα εγκλιματισμού σε διαφορετικές συνθήκες έντασης φωτός, αναδεικνύοντας την ενεργοποίηση φωτοπροστατευτικών μηχανισμών ως απόκριση στην περιβαλλοντική καταπόνηση. Η διαφοροποιημένη απόκριση (ευαισθησία) μεταξύ των μικροφυκών, παρατηρήθηκε και στα ζωοπλαγκτικά είδη που εξετάστηκαν (υδρόβια ασπόνδυλα) και στο βακτήριο Aliivibrio fischeri. Συγκεκριμένα, η Tetraglyme φαίνεται να επηρεάζει σε μεγαλύτερο βαθμό το είδος B. calyciflorus, ενώ το είδος D. magna εμφανίζει την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα. Στο βακτήριο A. fischeri παρατηρήθηκε αναστολή της βιοφωταύγειας, γεγονός που οδήγησε στον χαρακτηρισμό της ουσίας ως επιβλαβούς, βάσει των τιμών EC50, υποδηλώνοντας πιθανή διαταραχή στον μεταβολισμό του είδους, κυρίως σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, ενώ παράλληλα καταδεικνύεται ότι η Tetraglyme εμφανίζει χαμηλή τοξικότητα σε μικροοργανισμούς, χωρίς όμως να είναι πλήρως βιολογικά αδρανής. Επιπρόσθετα, η παρούσα έρευνα αποκάλυψε για πρώτη φορά ότι η Tetraglyme, ακόμη και σε περιβαλλοντικά ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις, μπορεί να προκαλέσει σημαντικές κυτταρικές, οξειδωτικές και γενοτοξικές επιπτώσεις στο είδος Mytilus galloprovincialis, όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα O2•−, NO, MDA και ROS, την αποσταθεροποίηση των λυσοσωμικών μεμβρανών και την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων στα αιμοκύτταρα των εκτιθέμενων ατόμων, ενώ ο σημαντικός αριθμός διαφοροποιημένων εκφραζόμενων γονιδίων (Differentially Expressed Genes/DEGs) στα βράγχια αποκάλυψε εκτεταμένες μοριακές διαταραχές και επιδράσεις σε μονοπάτια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό της Tetraglyme, τη σηματοδότηση, την απόπτωση, τη λυσοσωμική λειτουργία και την ομοιόσταση των κυττάρων. Στην περίπτωση των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Tetraglyme ή/και τα παράγωγά της δεν είναι κυτταροτοξικά, όσον αφορά την πρόκληση κυτταρικής θνησιμότητας, αλλά είναι ικανά να επάγουν ήπιο οξειδωτικό stress (παραγωγή ROS) και κυτταρο-γενοτοξικές επιπτώσεις, κυρίως στην περίπτωση προσθήκης εξωγενούς μεταβολικού συστήματος. Τέλος, οι υπολογιστικές προσομοιώσεις (molecular docking και molecular dynamics) έδειξαν πιθανά σημεία πρόσδεσης της Tetraglyme στην HEWL, καθώς και ενδεχόμενες δομικές επιδράσεις, χωρίς να επιβεβαιώνεται η πρόσδεση της ουσίας στην πρωτεϊνη, μέσω των XRPD, SCXRD και SSX κρυσταλλογραφικών δεδομένων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας αμφισβητούν τον μέχρι σήμερα χαρακτηρισμό της Tetraglyme ως περιβαλλοντικά φιλικής ουσίας, ένας χαρακτηρισμός που βασίστηκε κυρίως στη χαμηλή πτητικότητα και στη μειωμένη οξεία τοξικότητά της σε σύγκριση με άλλους οργανικούς διαλύτες. Τα ευρήματά μας αναδεικνύουν ότι η Tetraglyme είναι ικανή να επάγει στοχευμένες κυτταρικές και μοριακές αποκρίσεις, τονίζοντας την ανάγκη επαναξιολόγησης του περιβαλλοντικού κινδύνου που ενδέχεται να παρουσιάζει, με απώτερο στόχο την καλύτερη και ορθολογική χρήση/διαχείρισή της, καθώς και την πρόληψη και αποφυγή επιπτώσεων τόσο για το περιβάλλον όσο και για την ανθρώπινη υγεία.