Physically cross-linked protein-polysaccharide systems: complexation via electrostatic interactions

Abstract

This PhD thesis investigates the structure, thermodynamic behavior, and molecular dynamics of biopolymer-based systems in the form of hydrogels and aqueous solutions, with particular emphasis on the role of water and electrostatic interactions. The studied systems are: (1) xanthan gum (Xg), (2) xanthan–BSA (Xg–BSA) hydrogels, (3) chitosan–NaDES (Chit:NaDES) hydrogels with and without olive leaf extract, (4) alginate–NaDES (Alg:NaDES) hydrogels with and without olive leaf extract, and (5) lysozyme–poly(acrylic acid) (Lys–PAA) complexes studied in aqueous solution. In all systems except Lys–PAA, water is a key structural and functional component of the hydrogel network.The organization and stability of these materials are mainly governed by electrostatic interactions and hydrogen bonding. Water plays a dual role: it acts as a plasticizer enhancing molecular mobility, and as a structural element that controls thermodynamic stability and dynamics. Depending on hydration and polymer–water interactions, water may exist as non-freezable water, confined/bound water, or crystallized water forming a separate ice phase. The experimental investigation relied primarily on Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Broadband Dielectric Spectroscopy (BDS). DSC was used to determine the glass transition temperature (Tg), crystallization/cold-crystallization/melting events, and the hydration threshold for water crystallization. BDS enabled identification of dielectric relaxation processes and the temperature dependence of conductivity, providing insight into the dynamics of both the polymer matrix and water molecules. For Lys–PAA, additional techniques (SLS, DLS, ELS, FTIR, UV–Vis, and Circular Dichroism) were employed to characterize nanoparticle size, structure, and stability.Xanthan gum hydrogels (Xg)Xg samples were equilibrated at relative humidities 33%, 65%, 75%, 85%, 95%, and 98%, achieving hydration levels hw = 0.07–0.70, while one sample was fully dried. DSC showed that water crystallizes only at the two highest hydrations (hw = 0.36 and 0.70), with crystallization peaks at −21 and −20 °C and melting peaks at −5 and −1 °C, respectively. A glass transition step was detected in all samples, and Tg decreases strongly with increasing hydration, confirming the plasticizing role of water. TMDSC was additionally used for the dry sample and low-hydration samples (hw = 0.07 and 0.17). BDS confirmed water crystallization in the highly hydrated samples. For low hydrations (dry to hw = 0.27), one relaxation (process I) follows Arrhenius behavior and is attributed to a secondary (β) relaxation of the polymer (local backbone/side-group motions). Its acceleration with hydration reflects coupling between polymer polar groups and water reorientation dynamics. At hw = 0.27, an additional process (II) with VTF temperature dependence was detected and linked to conductivity, supported by BNN fitting. At hw = 0.36 and 0.70, an ice relaxation appears; at hw = 0.70, a fast double process (Iai, Iaii) with low activation energy is also observed. In dc conductivity, a low-temperature Arrhenius process (low activation energy) is assigned to crystalline ice, while a second process at higher temperatures appears across all samples with similar activation energy, suggesting a common long-range transport mechanism.Xg–BSA hydrogelsTwo hydrogel series were prepared, one thermally treated at 90 °C for 5 min. After equilibration at 33%, 65%, 85%, and 98% RH, most samples had too low mass (<2 mg) for DSC; only “as received” and 98% RH samples were measurable. DSC showed crystallization and melting peaks in both treated and untreated samples, with no additional thermal events. BDS revealed that the same relaxation processes occur with or without thermal treatment, indicating limited influence of heating on dielectric behavior at the relaxation level. Process I (Arrhenius) is attributed to β-relaxation and accelerates with hydration. In highly hydrated samples, process Ia (Arrhenius, Eact ~ 0.20 eV) is assigned to secondary relaxation of non-freezable water in the hydration shell. An additional Ice process exhibits relaxation times at least one order of magnitude faster than pure hexagonal ice and reduced dielectric strength (Δε ~ 10 vs Δε ~ 15–50), consistent with defect-rich ice (Bjerrum defects). For dc conductivity, an Arrhenius process with Eact = 0.22 eV at low temperatures is assigned to ice, while a higher-temperature process with Eact = 0.8–1 eV appears in all samples, shifting to lower temperatures with increasing hydration. The similar activation energies across samples in the range −90 to −10 °C indicate comparable charge-transport processes and suggest a specific network of adsorbed/interfacial water molecules; above about −80 °C, transport is likely facilitated through the hydrogen-bond network of non-freezing water.Lys–PAA complexes (aqueous solutions)Lys–PAA complexation was studied at pH 7, using mass ratios rm = CPAA/CLYS = 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, and then examined at pH 7 and pH 12 with and without thermal treatment. SLS showed that, for all rm values and conditions, complex scattering intensity is much higher than that of the individual components, indicating high-molar-mass nanoparticle formation driven by strong electrostatic association (even at low PAA). Heat-treated samples scatter more strongly, suggesting enhanced coupling of free protein to the nanoparticles due to partial unfolding and Lys–Lys association. DLS confirmed that heating promotes well-defined nanostructures; at pH 12, heat treatment yields a single population with a hydrodynamic radius comparable to that at pH 7. The radius of gyration is 100–250 nm. CD and FTIR consistently show decreased α-helix and increased β-sheet content after complexation and thermal treatment, supporting partial/complete unfolding of α-helical domains. ELS indicates that nanoparticle surface potential is mainly governed by lysozyme net charge, especially at pH 12. DSC on lysozyme at different hydration levels shows hydration-dependent denaturation: at hw = 0.14 and 0.19, no ice crystallization/melting occurs and denaturation is irreversible, followed by a glass transition; at hw = 0.40, crystallization/melting becomes prominent and denaturation is more gradual, indicating a hydration threshold where thermal transitions shift from glass-like to hydration-driven behavior. Chit:NaDEShydrogelsTwo material series were prepared (with and without olive leaf extract), and each series was dried by two methods (oven-drying and freeze-drying). Samples were equilibrated at 65%, 85%, and 98% RH and also placed in a strong desiccant. The drying method did not significantly affect water uptake or the DSC thermal behavior. Tg decreases with hydration in all samples, except at maximum hydration (same hw = 0.67 for both drying methods), where Tg slightly increases because a fraction of water crystallizes and no longer contributes to plasticization. Cold crystallization upon heating was observed at 85% RH with small enthalpy. Olive leaf extract increases water uptake but does not qualitatively alter the DSC profile, with a large fraction of water remaining non-freezable. BDS (performed on oven-dried films) confirmed ice formation in the most hydrated samples (hw = 0.67 without extract and hw = 0.73 with extract) at ~−12 °C. The relaxation and dc-conductivity analysis showed hydration-dependent transitions between polymer-coupled dynamics (VTF-type) and ice-related Arrhenius conduction at maximum hydration, with increased complexity when the extract is present.Alg:NaDES hydrogelsAlg:NaDES and Alg:NaDES:Ol were oven-dried and equilibrated at 33%, 65%, 85%, and 98% RH, as well as in a strong desiccant, achieving hw = 0.04–0.71. DSC revealed Tg in all samples, decreasing with hydration due to plasticization; at maximum hydration (hw = 0.65 and 0.71), Tg slightly increases because part of the water crystallizes. Differences between samples with and without extract are most evident at 85% and 98% RH, reflecting distinct fractions of crystallized vs non-freezable water (e.g., 0.57 vs 0.40 non-freezable water). BDS confirmed ice in the most hydrated samples and identified a common low-hydration relaxation (process I) in both systems, assigned to localized side-chain motions, while higher-temperature processes with large Δε were attributed to interfacial polarization (MWS/electrode effects). At intermediate hydration, an ice-related process (Ice2) consistent with low-density amorphous ice was detected. At maximum hydration, a weak fast process (Eact ~ 0.32 eV) is attributed to secondary relaxation of uncrystallized/bound water, and a strong ice relaxation (Ice1, Δε ~ 30–100) shows deviations from bulk ice Ih due to confinement and matrix interactions. Dc conductivity shows two regimes: low-temperature Arrhenius behavior (ice-related transport, dominant at maximum hydration) and higher-temperature VTF behavior (matrix-coupled ionic transport). The olive leaf extract systematically lowers σdc and slightly shifts the VTF region to higher temperatures, consistent with stronger intermolecular interactions and reduced ion mobility. Overall, the results demonstrate that hydration level, water state (bound, free, or crystallized), and electrostatic interactions collectively determine the thermodynamic stability, molecular mobility, and charge transport properties of biopolymeric hydrogels and complexes. The systematic correlation between calorimetric transitions, dielectric relaxation mechanisms, and conductivity behavior provides a comprehensive framework for understanding water-mediated dynamics in soft biopolymeric materials. These findings contribute to the rational design of advanced biomaterials with tunable structural and functional properties for applications in biotechnology, pharmaceutical formulations, and soft matter systems.

Τίτλος: «Φυσικώς Σταυροδεμένα Συστήματα Πρωτεΐνης-Πολυσακχαρίτη: Σύμπλεξη μέσω Ηλεκτροστατικών Αλληλεπιδράσεων». Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη μελέτη της δομής, της θερμοδυναμικής συμπεριφοράς και της μοριακής δυναμικής βιοπολυμερικών συστημάτων σε μορφή υδρογελών και υδατικών διαλυμάτων, με ιδιαίτερη έμφαση στον ρόλο του νερού, των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Η μελέτη αφορά στα εξής συστήματα 1. Ξανθάνη (Xg), 2. Ξανθάνης σε σύμπλεξη με την πρωτεΐνη BSA (Xg–BSA), υδρογέλες 3. Χιτοζάνη με NaDES (Chit:NaDES), με και χωρίς εκχύλισμα φύλλου ελιάς 4. Αλγινικό με NaDES (Alg:NaDES), με και χωρίς εκχύλισμα φύλλου ελιάς 5. Λυσοζύμη σε σύμπλεξη με πολυακρυλικό οξύ (Lys-PAA)Όλα τα συστήματα, με εξαίρεση το σύστημα Lys–PAA που μελετήθηκε σε μορφή υδατικού διαλύματος, βρίσκονται σε μορφή υδρογελών, στις οποίες το νερό αποτελεί βασικό δομικό και λειτουργικό συστατικό. Η φυσική οργάνωση και η σταθερότητα των υπό μελέτη συστημάτων καθορίζονται κυρίως από τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις και τους δεσμούς υδρογόνου. Το νερό διαδραματίζει διπλό ρόλο, λειτουργώντας τόσο ως πλαστικοποιητής που ενισχύει τη μοριακή κινητικότητα, όσο και ως δομικό στοιχείο που επηρεάζει τη θερμοδυναμική σταθερότητα και τις δυναμικές ιδιότητες των συστημάτων. Ανάλογα με το ποσοστό υδάτωσης και τη φύση των αλληλεπιδράσεων με το πολυμερές, το νερό μπορεί να βρίσκεται σε διαφορετικές φυσικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου του μη κρυσταλλωμένου (non-freezable water), του περιορισμένου νερού (confined/bound water) και του νερού που κρυσταλλώνεται σχηματίζοντας ξεχωριστή φάση πάγου (crystallized water). Η πειραματική μελέτη βασίστηκε κυρίως στη χρήση Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC) και Διηλεκτρικής Φασματοσκοπίας Εναλλασσομένου Πεδίου (Broadband Dielectric Spectroscopy, BDS), τεχνικές που επιτρέπουν τη διερεύνηση τόσο των θερμοδυναμικών μεταβάσεων όσο και των μηχανισμών μοριακής κινητικότητας σε ευρύ φάσμα θερμοκρασιών και συχνοτήτων. Η τεχνική DSC χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας υαλώδους μετάβασης Tg, των μεταβάσεων κρυστάλλωσης, ψυχρής κρυστάλλωσης και τήξης, καθώς και του κρίσιμου ποσοστού υδάτωσης που απαιτείται για την εμφάνιση κρυστάλλωσης του νερού. Η τεχνική BDS επέτρεψε την ταυτοποίηση μηχανισμών διηλεκτρικής αποκατάστασης και τη μελέτη της θερμοκρασιακής εξάρτησης της αγωγιμότητας, παρέχοντας πληροφορίες για τη δυναμική τόσο της πολυμερικής μήτρας, όσο και των μορίων του νερού. Για το σύστημα Lys–PAA, χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον τεχνικές σκέδασης φωτός και φασματοσκοπικές τεχνικές (SLS, DLS, FTIR, Circular Dichroism και Electrophoretic Light Scattering), επιτρέποντας τον χαρακτηρισμό του μεγέθους, της δομής και της σταθερότητας των νανοσωματιδίων. Ως προς την Ξανθάνη, δείγματά της τοποθετήθηκαν και ισορρόπησαν σε ποικίλα ποσοστά σχετικής υγρασίας (33%, 65%, 75%, 85%, 95% και 98%) προκειμένου να επιτύχουμε διαφορετικά ποσοστά υδάτωσης. Επιτεύχθηκαν υδατώσεις από hw = 0.07-0.70, ενώ ένα δείγμα τοποθετήθηκε σε αφυδατικό μέσο για πλήρη ξήρανση. Τα πειράματα θερμιδομετρίας (DSC) έδειξαν πως το νερό δημιουργεί τη δική του φάση (κρυστάλλωση) μόνο στα δύο δείγματα με την μεγαλύτερη υδάτωση (hw = 0.36 και 0,70). Στα δείγματα αυτά καταγράφηκαν εξώθερμες κορυφές κρυστάλλωσης (−21 και −20 °C) και εξώθερμες κορυφές τήξης της κρυσταλλικότητας (−5 και −1 °C) αντίστοιχα. Παράλληλα, καταγράφηκε σκαλοπάτι υαλώδους μετάβασης σε όλα τα δείγματα. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός πως η θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης, Tg, μειώνεται σημαντικά με την αύξηση της υδάτωσης γεγονός που οφείλεται στο ότι το νερό δρα ως ισχυρός πλαστικοποιητής διευκολύνοντας την κινητικότητα των πολυμερικών αλυσίδων. Ειδικά για το ξηρό δείγμα και για αυτά με τις χαμηλότερες υδατώσεις (hw = 0.07 & 0.17) πραγματοποιήθηκαν και TMDSC πειράματα για την ανίχνευση της υαλώδους μετάβασης. Τα πειράματα BDS, μέσω των ισόχρονων μετρήσεων, επιβεβαίωσαν την κρυστάλλωση του νερού στα δύο δείγματα με την μεγαλύτερη υδάτωση. Ως προς τους μηχανισμούς διηλεκτρικής αποκατάστασης, για τα δείγματα με χαμηλές υδατώσεις (ξηρό ως και hw = 0.27) καταγράφηκε ένας μηχανισμός (I) που ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius. Δεδομένου ότι ο μηχανισμός αυτός καταγράφεται και στο ξηρό δείγμα δείχνει πως πρόκειται για έναν δευτερεύοντα μηχανισμό που σχετίζεται, είτε με τοπικές κινήσεις της κύριας αλυσίδας, είτε με κινήσεις πλευρικών ομάδων του πολυμερούς (β-χαλάρωση). Ο εν λόγω μηχανισμός γίνεται γρηγορότερος με αύξηση της υδάτωσης, καταδεικνύοντας την σχέση μεταξύ της διηλεκτρικής χαλάρωσης πολικών ομάδων ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασής τους με τα μόρια του νερού και του μηχανισμού χαλάρωσης των ίδιων των μορίων του νερού, λόγω αλλαγής προσανατολισμού. Στο δείγμα με hw = 0.27 καταγράφηκε ένας μηχανισμός (II) που παρουσιάζει μη γραμμική θερμοκρασιακή εξάρτηση (VTF). Ο μηχανισμός αυτός σχετίζεται με μηχανισμό αγωγιμότητας, όπως έδειξε το σχετικό fitting χρησιμοποιώντας την εμπειρική σχέση των Barton-Nakajima–Namikawa (BNN). Τέλος, στα δείγματα με τις μεγαλύτερες υδατώσεις (hw = 0.36 και 0.70) έχουμε την εμφάνιση του μηχανισμού χαλάρωσης του πάγου, ενώ ειδικά στο δείγμα με την μέγιστη υδάτωση, καταγράφηκε επίσης και ένας διπλός, γρήγορος μηχανισμός (Iai και Iaii) χαμηλής ωστόσο ενέργειας ενεργοποίησης. Ως προς τους μηχανισμούς dc αγωγιμότητας, εμφανίζεται στο δείγμα με την μέγιστη υδάτωση ένας μηχανισμός στις χαμηλές θερμοκρασίες και στην περιοχή μεσαίων συχνοτήτων, με χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης. Ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius (γραμμική) και αποδίδεται στην κρυσταλλική φάση του νερού, όπου αγώγιμοι δρόμοι δημιουργούνται μέσω των δομών του πάγου. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες εμφανίζεται και δεύτερος μηχανισμός σε όλα τα δείγματα που έχει σχεδόν την ίδια ενέργεια ενεργοποίησης και επομένως οφείλεται σε παρόμοιες διεργασίες σε μοριακό επίπεδο. Στο σύστημα Xg-BSA παρασκευάστηκαν δύο σειρές υδρογελών, η μία εκ των οποίων υπέστη θερμική κατεργασία στους 90 °C για 5 λεπτά. Οι υδρογέλες αυτές τοποθετήθηκαν και ισορρόπησαν σε γυάλες με ποσοστά σχετικής υγρασίας (33%, 65%, 85% και 98%). Δυστυχώς, η δομή τους σε κατάσταση ισορροπίας δεν ήταν συμπαγής και η μάζα τους πολύ μικρή (< 2 mg, κάτω από το όριο που χρειάζεται για τις μετρήσεις DSC) οπότε δεν κατέστη δυνατή η μέτρησή τους. Τα μόνα δείγματα που κράτησαν επαρκή μάζα ήταν τα «as received» και αυτά που ισορρόπησαν στη μέγιστη σχετική υγρασία 98%. Τα αποτελέσματα DSC κατέδειξαν την ύπαρξη κορυφών κρυστάλλωσης και τήξης και στα δύο δείγματα (με και χωρίς θερμική κατεργασία), ενώ δεν καταγράφηκε κάποιο άλλο θερμοδυναμικό φαινόμενο. Η τεχνική BDS ωστόσο, βοήθησε στην εξαγωγή συμπερασμάτων ως προς τους μηχανισμούς μοριακής κινητικότητας. Αρχικά πρέπει να σχολιάσουμε πως ο ίδιοι μηχανισμοί εμφανίζονται και στις δύο σειρές υδρογελών, με, ή χωρίς θερμική κατεργασία, γεγονός που δείχνει πως τουλάχιστον στο επίπεδο των μηχανισμών χαλάρωσης, η θερμική κατεργασία δεν έχει σημαντική επίδραση στη διηλεκτρική συμπεριφορά των υλικών. Ο πρώτος μηχανισμός (I) ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius (γραμμική) και ανιχνεύεται σε όλα τα δείγματα εκτός αυτών με τη μέγιστη υδάτωση (hw=0.95 και 0.86 για τα δείγματα χωρίς και με θερμική κατεργασία αντίστοιχα). Αυτός ο μηχανισμός αποδίδεται σε τοπικές κινήσεις πλευρικών ομάδων (β-χαλάρωση) και η δυναμική του επηρεάζεται σημαντικά από τα μόρια του νερού που τον καθιστούν πιο γρήγορο με αύξηση της υδάτωσης στα δείγματα. Παρόμοιοι μηχανισμοί έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία σε συστήματα υδατωμένων πολυμερών. Ένας ακόμα μηχανισμός (Ia) που και αυτός ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius, με χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης (περί τα 0.20 eV) καταγράφεται σε χαμηλές θερμοκρασίες στα δείγματα με τη μέγιστη υδάτωση. Αυτός αποδίδεται σε δευτερεύοντα μηχανισμό διηλεκτρικής αποκατάστασης του μη κρυσταλλωμένου νερού που καταλαμβάνει τις διαθέσιμες θέσεις υδάτωσης στις πολυμερικές αλυσίδες (hydration shell). Τέλος, στα δείγματα με την μέγιστη υδάτωση εμφανίζεται και ένας ακόμα μηχανισμός (Ice) του οποίου ο χρόνος αποκατάστασης είναι τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους πιο γρήγορος από αυτόν του καθαρού εξαγωνικού πάγου. Μπορεί να αποδοθεί στην ύπαρξη πάγου με πολλές ατέλειες (Bjerrum defects (L- and D-type orientational defects). Η εξήγηση αυτή υποστηρίζεται και από την χαμηλή διηλεκτρική ισχύ του μηχανισμού (Δε~10) συγκριτικά με αυτήν του καθαρού πάγου (Δε~15-50). Ως προς την dc αγωγιμότητα, στα δύο δείγματα με την μέγιστη υδάτωση, εμφανίζεται ένας μηχανισμός με συμπεριφορά Arrhenius, με ενέργεια ενεργοποίησης 0.22 eV, στις χαμηλές θερμοκρασίες και την περιοχή μεσαίων συχνοτήτων που μπορεί να αποδοθεί στην κρυσταλλική φάση του νερού, όπου αγώγιμα μονοπάτια δημιουργούνται μέσω των δομών του πάγου. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες, ένας ακόμα μηχανισμός αγωγιμότητας εμφανίζεται σε όλα τα δείγματα και ανεξάρτητα από την υδάτωση και την θερμική κατεργασία, με ενέργεια ενεργοποίησης μεταξύ 0.8-1 eV. Αυτός ο μηχανισμός μετατοπίζεται συστηματικά σε χαμηλότερες θερμοκρασίες με αύξηση της υδάτωσης, τόσο στα κατεργασμένα, όσο και στα μη κατεργασμένα δείγματα. Αυτή η συμπεριφορά υποδηλώνει ότι παρόμοιες διεργασίες μεταφοράς φορτίου ενεργοποιούνται σε όλα τα δείγματα εντός του θερμοκρασιακού εύρους –90 έως –10 °C, γεγονός που υποδεικνύει την παρουσία ενός συγκεκριμένου δικτύου προσροφημένων μορίων νερού. Στα πλήρως ενυδατωμένα δείγματα, η πρόσθετη διεργασία αγωγιμότητας σε χαμηλές θερμοκρασίες, η οποία αποδίδεται στη φάση του πάγου, ενισχύει περαιτέρω αυτή την ερμηνεία. Πάνω από περίπου –80 °C, είναι εύλογο να υποτεθεί ότι η μεταφορά φορτίου μπορεί να διευκολύνεται μέσω του δικτύου δεσμών υδρογόνου (HB) του μη κρυσταλλωμένου νερού που υπάρχει στα δείγματα. Παρόμοιες υψηλές τιμές ενέργειας ενεργοποίησης έχουν επίσης αναφερθεί και για άλλα συστήματα που περιέχουν νερό και γενικά αποδίδονται στα ιδιαίτερα δομικά χαρακτηριστικά του δικτύου δεσμών υδρογόνου του διεπιφανειακού νερού, καθώς και στους ειδικούς μηχανισμούς που διέπουν τη μεταφορά πρωτονίων. Το σύστημα Λυσοζύμης-Πολυακρυλικού οξέος (Lys-PAA) που ήταν σε μορφή υδατικού διαλύματος, μελετήθηκε κυρίως με τεχνικές σκέδασης και φασματοσκοπικές τεχνικές (DLS, SLS, ELS, FTIR, Uv-VIS, CD) και συμπληρωματικά με τις τεχνικές DSC και BDS. Αφού πραγματοποιήθηκαν διάφορες αρχικές μετρήσεις, επιλέχθηκαν οι εξής αναλογίες μαζών για την σύμπλεξη : rm = CPAA/CLYS = 0.003, 0.01, 0.03 και 0.1. Η σύμπλεξη έλαβε χώρα σε pH 7, και εν συνεχεία δείγματα από την κάθε αναλογία, υπέστησαν θερμική κατεργασία και μετρήθηκαν σε pH 7 και σε pH 12. Η στατική σκέδαση φωτός έδειξε πως για όλες τις τιμές του rm και υπό όλες τις συνθήκες, η ένταση σκέδασης των συμπλόκων είναι σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των μεμονωμένων συστατικών, γεγονός που υποδηλώνει τον σχηματισμό σύνθετων νανοσωματιδίων με υψηλή μοριακή μάζα. Αυτή η ενίσχυση της σκέδασης υποδεικνύει ισχυρές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της θετικά φορτισμένης Lys και των αρνητικά φορτισμένων αλυσίδων PAA, ακόμη και σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις PAA. Το αυξημένο σήμα που παρατηρείται σε όλα τα διαγράμματα Guinier επιβεβαιώνει τον σχηματισμό νανοδομημένων συμπλόκων, ανεξάρτητα από τον λόγο ανάμιξης. Επίσης, τα θερμικώς κατεργασμένα δείγματα εμφανίζουν σημαντικά ισχυρότερη σκέδαση, γεγονός που δείχνει πως η θερμική κατεργασία ενισχύει περαιτέρω τη σύζευξη των ελεύθερων πρωτεϊνικών μορίων με τα σχηματιζόμενα νανοσωματίδια, εξαιτίας της μερικής αποδιάταξης των πρωτεϊνών που οδηγεί σε σύζευξη Lys-Lys. Παράλληλα, τα πειράματα DLS έδειξαν πως η θερμική κατεργασία (ανεξάρτητα από το pH) ευνοεί τη δημιουργία νανοδομών με καλώς καθορισμένη υδροδυναμική ακτίνα. Ειδικά σε αλκαλικό περιβάλλον (pH 12) η θερμική κατεργασία έχει ως αποτέλεσμα την ύπαρξη ενός μόνο πληθυσμού στο διάλυμα με υδροδυναμική ακτίνα τάξης μεγέθους nm παρόμοια με αυτή σε περιβάλλον με pH 7. Ως προς τα καταγραφόμενα μοριακά βάρη, αξιοσημείωτο είναι το γεγονός πως όταν τα δείγματα υπόκεινται σε θερμική κατεργασία οι τιμές τους είναι σχεδόν οι ίδιες σε όλες τις συνθήκες και ανεξάρτητα από το pH. Η γυροσκοπική ακτίνα κυμαίνεται μεταξύ 100-250 nm σε κάθε περίπτωση. Επιπροσθέτως, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις τεχνικές CD και FTIR παρουσιάζουν ισχυρή συμφωνία, αναδεικνύοντας με συνέπεια τις βασικές επιδράσεις της μερικής αποδιάταξης λόγω θερμικής κατεργασίας και ηλεκτροστατικής σύμπλεξης. Συγκεκριμένα, και οι δύο τεχνικές καταδεικνύουν σαφή τάση μείωσης της δομής α-έλικα και αύξησης του β-πτυχωτού φύλλου κατόπιν σύμπλεξης και θερμικής επεξεργασίας. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι τόσο οι θερμικές όσο και οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις συμβάλλουν στη δομική αναδιάταξη της πρωτεΐνης, υποστηρίζοντας την υπόθεση ενισχυμένου σχηματισμού β-πτυχωτών δομών και μερικής, ή πλήρους αποδιάταξης των περιοχών α-έλικας της Lys. Επιπλέον, πειράματα ηλεκτροφορητικής σκέδασης φωτός (ELS) έδειξαν ότι το επιφανειακό δυναμικό των νανοσωματιδίων καθορίζεται κυρίως από το καθαρό φορτίο της Lys, ιδιαίτερα στο pH 12. Η ανάλυση DSC αποκαλύπτει ότι η θερμική συμπεριφορά της Lys εξαρτάται έντονα από τον βαθμό υδάτωσης. Σε χαμηλή υδάτωση (hw = 0.14 και 0.19), δεν παρατηρείται κρυστάλλωση, ή τήξη πάγου, ενώ η θερμική αποδιάταξη χαρακτηρίζεται από μη αντιστρεπτές μεταβάσεις, ακολουθούμενες από την εμφάνιση μιας υαλώδους μετάβασης. Η θερμοκρασία αποδιάταξης μειώνεται με την αύξηση της ενυδάτωσης, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες. Οι ομοιότητες μεταξύ των δειγμάτων με hw = 0.14 και 0.19 υποδηλώνουν ότι η Lys βρίσκεται σε άμορφη κατάσταση με περιορισμένη μοριακή κινητικότητα υπό αυτές τις συνθήκες. Αντίθετα, σε υδάτωση hw = 0.40, η κρυστάλλωση και η τήξη του νερού καθίστανται εμφανείς, ενώ η θερμική αποδιάταξη λαμβάνει χώρα πιο σταδιακά. Η παρουσία ψυχρής κρυστάλλωσης και η καθυστερημένη υαλώδης μετάβαση σε αυτό το επίπεδο ενυδάτωσης αντανακλούν τη σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ της Lys και των μορίων νερού.Ως προς το σύστημα Χιτοζάνης με NaDES, παρασκευάστηκαν δύο σειρές υλικών εκ των οποίων η μία περιείχε και εκχύλισμα φύλλου ελιάς. Παράλληλα, κάθε σειρά υπέστη ξήρανση με δύο τρόπους : ξήρανση σε φούρνο και ξήρανση με λυοφιλοποίηση. Δείγματα με και χωρίς εκχύλισμα, που υπέστησαν ξήρανση και με τους δύο τρόπους, τοποθετήθηκαν σε γυάλες με σχετική υγρασία 65, 85 και 98% ενώ τοποθετήθηκαν και σε ισχυρό αφυδατικό για να αφαιρεθεί ακόμα και η μικρή ποσότητα νερού που μπορεί να περιείχαν. Αρχικά πρέπει να τονίσουμε πως ο τρόπος ξήρανσης δεν είχε σημαντική επίδραση στην απορρόφηση νερού από τα δείγματα. Ξεκινώντας με τα αποτελέσματα DSC και για τα δείγματα χωρίς εκχύλισμα (Chit:NaDES) φάνηκε πως ο τρόπος ξήρανσης δεν επηρεάζει τη θερμοδυναμική συμπεριφορά των δειγμάτων καθώς παρατηρήθηκαν οι ίδιες θερμικές μεταβάσεις με μικρές διαφορές στις σχετικές κρίσιμες θερμοκρασίες. Πιο συγκεκριμένα, σκαλοπάτι υαλώδους μετάβασης καταγράφηκε σε όλα τα δείγματα με μείωση της θερμοκρασίας υαλώδους μετάβασης με αύξηση της υδάτωσης με εξαίρεση τα δείγματα με την μέγιστη υδάτωση (ίδια υδάτωση hw = 0.67 για ξήρανση σε φούρνο και με λυοφιλοποίηση) όπου αυξάνεται ελάχιστα. Η μείωση οφείλεται στην ύπαρξη του νερού που δρα ως ισχυρός πλαστικοποιητής διευκολύνοντας την κινητικότητα των πολυμερικών αλυσίδων. Ωστόσο, στη μέγιστη υδάτωση, το νερό δημιουργεί τη δική του φάση (κρυστάλλωση) και το μέρος αυτό δεν συμμετέχει στην πλαστικοποίηση αυτή. Αξίζει να αναφέρουμε πως σε σχετική υγρασία 85%, παρατηρήθηκε ψυχρή κρυστάλλωση κατά τη θέρμανση με μικρή ωστόσο αντίστοιχη ενθαλπία. Στα δείγματα με εκχύλισμα (Chit:NaDES:Ol) επίσης φάνηκε πως ο τρόπος ξήρανσης δεν επιδρά σημαντικά στην θερμοδυναμική συμπεριφορά. Καταγράφονται ίδιες μεταβάσεις συγκριτικά με τα δείγματα χωρίς εκχύλισμα με τα ίδια χαρακτηριστικά. Συνοψίζοντας, η ανάλυση DSC καταδεικνύει ότι η περιεκτικότητα σε χιτοζάνη και σε νερό αποτελεί τον κύριο παράγοντα που καθορίζει τη θερμική συμπεριφορά του συστήματος. Η χιτοζάνη διευρύνει την περιοχή της υαλώδους μετάβασης και μειώνει την ψυχρή κρυστάλλωση, αντανακλώντας αυξημένη δομική ετερογένεια και περιορισμένη μοριακή κινητικότητα. Η παρουσία εκχυλίσματος φύλλου ελιάς ενισχύει την πρόσληψη νερού, χωρίς ωστόσο να μεταβάλλει ποιοτικά το θερμικό προφίλ, καθώς σημαντικό κλάσμα του νερού παραμένει σε μη κρυσταλλωμένη μορφή. Τα πειράματα με την τεχνική BDS πραγματοποιήθηκαν μόνο στα υλικά που ξηράνθηκαν σε φούρνο, καθώς η μορφολογία τους (λεπτά υμένια) ήταν καταλληλότερη συγκριτικά με αυτά που ξηράνθηκαν με λυοφιλοποίηση (σπογγώδη υλικά). Μέσω των ισόχρονων πειραμάτων επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη πάγου στα δύο δείγματα με την μέγιστη υδάτωση (hw = 0.67 και 0.73 χωρίς και με εκχύλισμα φύλλου ελιάς αντίστοιχα) σε θερμοκρασία περί τους −12 o C.Ως προς τους μηχανισμούς διηλεκτρικής αποκατάστασης που παρατηρήθηκαν, αρχίζοντας με αυτά χωρίς εκχύλισμα και το δείγμα “as received” ανιχνεύεται μόνο ένας μηχανισμός (III) σε υψηλές θερμοκρασίες και αποδίδεται σε φαινόμενα ενδοεπιφανειακής πόλωσης και όχι από την πολυμερική μήτρα. Στο δείγμα με hw=0.22 εμφανίζονται δύο μηχανισμοί αποκατάστασης. Ο πρώτος (I) ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius με ενέργεια ενεργοποίησης Eact = 0.62 eV και σχετικά χαμηλή διηλεκτρική ισχύ. Ο μηχανισμός αυτός αποδίδεται σε δευτερεύουσα, β χαλάρωση, η οποία σχετίζεται με τοπικές κινήσεις πλευρικών ομάδων των πολυμερικών αλυσίδων. Ο δεύτερος μηχανισμός (III) εμφανίζεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες και εντάσσεται σε περιοχή όπου κυριαρχούν φαινόμενα πόλωσης ηλεκτροδίων, συνεπώς δεν λαμβάνεται περαιτέρω υπόψη στην παρούσα ανάλυση. Στο επόμενο επίπεδο υδάτωσης (hw = 0.37) αναδύονται τρεις μηχανισμοί αποκατάστασης. Ο πρώτος (I) εμφανίζει παρόμοια ενέργεια ενεργοποίησης με εκείνη του δείγματος hw = 0.22, αλλά μετατοπίζεται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Η μετατόπιση αυτή ενισχύει την ερμηνεία ότι μπορεί να αποδοθεί στην ίδια δευτερεύουσα μοριακή διεργασία, με το νερό να δρα ως πλαστικοποιητής που ενισχύει την τοπική κινητικότητα των αλυσίδων. Ένας δεύτερος μηχανισμός (II) εμφανίζεται σε ελαφρώς υψηλότερες θερμοκρασίες αλλά σε συγκρίσιμη χρονική κλίμακα. Και οι δύο μηχανισμοί ακολουθούν συμπεριφορά Arrhenius και παρουσιάζουν χαμηλές τιμές διηλεκτρικής ισχύος, και αποδίδονται σε τοπικές κινήσεις (δευτερεύοντες μηχανισμοί). Όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, ο τρίτος μηχανισμός σε υψηλές θερμοκρασίες εξαιρείται από περαιτέρω συζήτηση λόγω έντονων συνεισφορών διεπιφανειακής πόλωσης. Για το δείγμα με την μεγαλύτερη υδάτωση (hw = 0.67), ανιχνεύονται εκ νέου τρεις μηχανισμοί αποκατάστασης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο μηχανισμός που σημειώνεται ως «Ice», ο οποίος αντιστοιχεί σε μηχανισμό σχετιζόμενο με τον πάγο και εμφανίζει διαφορετική χρονική κλίμακα αποκατάστασης σε σύγκριση με τον καθαρό εξαγωνικό πάγο, καθώς και διηλεκτρική ισχύ Δε ~ 10, χαμηλότερη από εκείνη που παρατηρείται συνήθως για τον εξαγωνικό πάγο. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει την παρουσία δομικά αποδιοργανωμένου πάγου με υψηλή συγκέντρωση ατελειών, όπως έχει αναφερθεί και σε παρόμοια συστήματα (π.χ. σύστημα Xg–BSA). Ο μηχανισμός αυτός παρατηρείται επίσης, όπως θα συζητηθεί στη συνέχεια, και στο δείγμα με εκχύλισμα στη μέγιστη υδάτωση. Ο δεύτερος μηχανισμός (II) εμφανίζει χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα του δείγματος hw = 0.37, υποδηλώνοντας παρόμοια προέλευση σε μοριακό επίπεδο. Ο τρίτος μηχανισμός (III) εμφανίζεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες και εντάσσεται σε περιοχή όπου κυριαρχούν φαινόμενα πόλωσης ηλεκτροδίων, και επομένως δεν εξετάζεται περαιτέρω. Ως προς τα δείγματα που περιέχουν εκχύλισμα φύλλου ελιάς, η διηλεκτρική απόκριση παρουσιάζει αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις. Στο “as received” δείγμα ανιχνεύεται ένας γρήγορος μηχανισμός αποκατάστασης σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες (έως περίπου −120 °C), ο οποίος ακολουθεί γραμμική συμπεριφορά Arrhenius. Επιπλέον, ένας δεύτερος μηχανισμός εμφανίζεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες (άνω των −100 °C), επίσης με συμπεριφορά Arrhenius, σχετικά χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης (Eact = 0.52 eV) και χαμηλή διηλεκτρική ισχύ. Τα χαρακτηριστικά αυτά υποδηλώνουν τοπικές μοριακές κινήσεις. Για το δείγμα με hw = 0.08 καταγράφεται ο μηχανισμός (I) με συμπεριφορά Arrhenius, ενέργεια ενεργοποίησης Eact = 0.53 eV και χαμηλή διηλεκτρική ισχύ. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η εμφάνιση δεύτερου μηχανισμού (IIVTF) που ακολουθεί συμπεριφορά Vogel–Tammann–Fulcher (VTF), ο οποίος αποδίδεται στη α-χαλάρωση της πολυμερικής μήτρας και συνδέεται με τη δυναμική της υαλώδους μετάβασης. Η ερμηνεία αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι το ίχνος του μηχανισμού στο διάγραμμα Arrhenius προσεγγίζει τη θερμοκρασία υαλώδους μετάβασης (Tg) που προσδιορίστηκε από τις μετρήσεις DSC. Στο δείγμα με υδάτωση hw = 0.38, ο μηχανισμός I διατηρεί παρόμοια χαρακτηριστικά με εκείνα στο hw = 0.08, αλλά μετατοπίζεται σε ελαφρώς υψηλότερες θερμοκρασίες, υποδηλώνοντας φαινόμενα πλαστικοποίησης λόγω της αυξημένης περιεκτικότητας σε νερό. Ένας δεύτερος μηχανισμός εμφανίζεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες (άνω των −100 °C), επίσης με συμπεριφορά Arrhenius, σχετικά χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης (Eact = 0.73 eV) και χαμηλή διηλεκτρική ισχύ. Ο μηχανισμός αυτός αντιστοιχεί στον ίδιο μηχανισμό (II) που παρατηρήθηκε στο δείγμα χωρίς εκχύλισμα στο hw = 0.37 και αποδίδεται σε τοπικές μοριακές κινήσεις πλευρικών αλυσίδων του πολυσακχαρίτη. Επιπλέον, ένας τρίτος μηχανισμός (III) εμφανίζεται άνω των −80 °C, ενώ οι διεργασίες σε ακόμη υψηλότερες θερμοκρασίες εξαιρούνται λόγω κυριαρχίας διεπιφανειακής πόλωσης. Τέλος, στο δείγμα με το μεγαλύτερο ποσοστό νερού (hw = 0.73), η διηλεκτρική απόκριση καθίσταται σημαντικά πιο σύνθετη. Ανιχνεύονται δύο ταχείς μηχανισμοί αποκατάστασης (Iai και Iaii) σε χαμηλές θερμοκρασίες, με μικρές τιμές ενέργειας ενεργοποίησης. Παρόμοιοι μηχανισμοί έχουν αναφερθεί σε συστήματα βασισμένα στη ξανθάνη, γεγονός που υποδηλώνει κοινή φυσική προέλευση σχετιζόμενη με τη δυναμική του κελύφους ενυδάτωσης. Επιπλέον, παρατηρείται ο μηχανισμός (Ice) του οποίου η χαρακτηριστική χρονική κλίμακα είναι τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους ταχύτερη από εκείνη του καθαρού εξαγωνικού πάγου (Ih). Η διηλεκτρική χαλάρωση του μηχανισμού αυτού ελέγχεται από την παρουσία ατελειών τύπου Bjerrum (L- και D- ατέλειες), οι οποίες διευκολύνουν τον επαναπροσανατολισμό των μορίων εντός του δικτύου δεσμών υδρογόνου. Η ταχύτερη χρονική κλίμακα αποκατάστασης υποδηλώνει ενισχυμένη δυναμική πρωτονίων μέσω ατελειών και αυξημένη κινητικότητα αυτών. Ο μηχανισμός αυτός αποδίδεται σε δομικά αποδιοργανωμένη, πλούσια σε ατέλειες μορφή πάγου, η οποία πιθανότατα σχηματίζεται υπό συνθήκες περιορισμού. Αναφορικά με τους μηχανισμούς dc αγωγιμότητας, και με αρχή τα δείγματα χωρίς εκχύλισμα, καταγράφεται μηχανισμός σε όλα τα επίπεδα υδάτωσης. Συγκεκριμένα, σε όλα τα δείγματα εκτός από εκείνο με τη μέγιστη υδάτωση (hw = 0.67), η θερμοκρασιακή εξάρτηση της dc αγωγιμότητας ακολουθεί συμπεριφορά Vogel–Tammann–Fulcher (VTF), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μακροσκοπική κίνηση φορτίων ελέγχεται από τη δυναμική των κινήσεων του άμορφου πολυμερικού δικτύου. Επιπλέον, οι καμπύλες αγωγιμότητας συγκλίνουν σε παρόμοιες τιμές σε υψηλότερες θερμοκρασίες, υποδεικνύοντας ότι η ίδια διεργασία μεταφοράς φορτίου μεγάλης εμβέλειας κυριαρχεί ανεξάρτητα από το επίπεδο υδάτωσης. Αντίθετα, στο δείγμα με τη μέγιστη υδάτωση, η αγωγιμότητα ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius έως περίπου τους −10 °C, θερμοκρασία που συμπίπτει με την τήξη της κρυσταλλικής φάσης, όπως επιβεβαιώνεται από τις μετρήσεις DSC. Η διεργασία τύπου Arrhenius αποδίδεται στην κρυσταλλική φάση του πάγου, όπου σχηματίζονται αγώγιμα μονοπάτια μέσω δομών πάγου, διευκολύνοντας τη μεταφορά φορτίου. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες, μετά την τήξη του πάγου, η αγωγιμότητα μεταβαίνει σε συμπεριφορά VTF, αντανακλώντας μηχανισμό μεταφοράς φορτίου που ελέγχεται από την πολυμερική μήτρα και τη σχετική δυναμική δομικής χαλάρωσης. Για τα δείγματα που περιέχουν εκχύλισμα παρατηρείται συνολικά παρόμοια συμπεριφορά. Σε όλα τα δείγματα, εκτός από εκείνο με τη μέγιστη υδάτωση (hw = 0.73), η dc αγωγιμότητα ακολουθεί συμπεριφορά Vogel–Tammann–Fulcher (VTF), υποδεικνύοντας ότι η μεταφορά φορτίου καθορίζεται από τη δυναμική των κινήσεων του άμορφου πολυμερικού δικτύου. Επιπλέον, οι κλίσεις των καμπυλών αγωγιμότητας στα αντίστοιχα θερμοκρασιακά διαστήματα είναι συγκρίσιμες, γεγονός που υποδηλώνει κοινή φυσική προέλευση των μηχανισμών. Στο δείγμα με τη μέγιστη υδάτωση ανιχνεύονται δύο διακριτοί μηχανισμοί dc αγωγιμότητας. Ο μηχανισμός υψηλών συχνοτήτων (HF) ακολουθεί συμπεριφορά Arrhenius και χαρακτηρίζεται από σχετικά χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης (Eact = 0.28 eV). Η διεργασία αυτή αποδίδεται στην κρυσταλλική φάση του πάγου, όπου δημιουργούνται αγώγιμα μονοπάτια μέσω των δομών του πάγου. Ο δεύτερος μηχανισμός, χαμηλών συχνοτήτων (LF), παρουσιάζει επίσης συμπεριφορά Arrhenius έως περίπου τους −20 °C, θερμοκρασία που συμπίπτει με το φαινόμενο κρυστάλλωσης. Πάνω από τη θερμοκρασία αυτή, η αγωγιμότητα καθίσταται μη γραμμική και ακολουθεί συμπεριφορά VTF, υποδηλώνοντας μετάβαση από μεταφορά φορτίου που κυριαρχείται από τον πάγο σε μηχανισμό ελεγχόμενο από την πολυμερική μήτρα και τη δυναμική δομικής της χαλάρωσης. Το τελευταίο υπό μελέτη σύστημα της διατριβής αυτής είναι αυτό του αλγινικού σε σύμπλεξη με διαλύτη NaDES, χωρίς και με εκχύλισμα φύλλου ελιάς (Alg:NaDES και Alg:NaDES:Ol). Βάσει της προηγούμενης εμπειρίας μας με το σύστημα Χιτοζάνης-NaDES, επιλέχθηκε ως τρόπος ξήρανσης των υλικών η ξήρανση σε φούρνο, δεδομένου ότι η μορφολογία τους είναι καταλληλότερη, ειδικά για τις μετρήσεις με την τεχνική BDS. Δείγματα από τα δύο υλικά (χωρίς και με εκχύλισμα) τοποθετήθηκαν και ισορρόπησαν σε σχετική υγρασία 33, 65, 85 και 98% ενώ δείγματα τοποθετήθηκαν και σε γυάλα με ισχυρό αφυδατικό για πλήρη απομάκρυνση του νερού. Επιτεύχθησαν υδατώσεις που κυμαίνονται από hw = 0.04 ως 0.71. Πρέπει να σημειώσουμε εδώ ότι τα δείγματα χωρίς εκχύλισμα φύλλου ελιάς απορρόφησε σε κάθε σχετική υγρασία περισσότερο νερό, με εξαίρεση τη μέγιστη σχετική υγρασία. Και στις δύο σειρές δειγμάτων (χωρίς και με εκχύλισμα) οι μετρήσεις DSC κατέδειξαν την ύπαρξη υαλώδους μετάβασης με τη σχετική θερμοκρασία Tg να μειώνεται με αύξηση της υδάτωσης, φαινόμενο που έχει καταγραφεί σε ποικίλα παρόμοια πολυμερικά συστήματα. Η μείωση αυτή οφείλεται στο ότι το νερό δρα ως ισχυρός πλαστικοποιητής. Ωστόσο, στα δείγματα με τη μέγιστη υδάτωση (hw = 0.65 και 0.71 χωρίς και με εκχύλισμα αντίστοιχα) η Tg αυξάνεται λίγο, γεγονός που αποδίδεται στην κρυστάλλωση μέρους του νερού που δεν συμμετέχει πλέον στην πλαστικοποίηση. Τα συγκριτικά θερμογράμματα ψύξης-θέρμανσης μεταξύ δειγμάτων με και χωρίς εκχύλισμα που ισορρόπησαν σε ίδια σχετική υγρασία, κατέδειξαν διαφορές μόνο στα δείγματα σε σχετική υγρασία 85 και 98%. Συγκεκριμένα, σε σχετική υγρασία 85% καταγράφεται και στα δύο δείγματα εξώθερμη κορυφή ψυχρής κρυστάλλωσης κατά τη θέρμανση, ωστόσο η κορυφή αυτή είναι οξεία στο δείγμα χωρίς εκχύλισμα και με σημαντικά αυξημένη ενθαλπία κρυστάλλωσης. Αυτό αντικατοπτρίζεται και στην αντίστοιχη εξώθερμη κορυφή τήξης της κρυσταλλικότητας. Η κατάσταση είναι διαφορετική στα δείγματα που ισορρόπησαν σε σχετική υγρασία 98%. Το δείγμα με εκχύλισμα εμφανίζει εμφανώς πιο οξεία κορυφή κρυστάλλωσης και αντίστοιχη κορυφή τήξης, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στην αυξημένη απορρόφηση νερού αλλά και δεδομένου ότι το αντίστοιχο δείγμα χωρίς εκχύλισμα περιέχει μεγαλύτερο ποσοστό μη κρυσταλλωμένου νερού (0.57 έναντι 0.40). Συνεχίζουμε με τις μετρήσεις με την τεχνική BDS. Τα ισόχρονα πειράματα επιβεβαίωσαν την ύπαρξη πάγου στα δύο δείγματα με την μεγαλύτερη υδάτωση (hw=0.65 και 0.71 χωρίς και με εκχύλισμα). Συνεχίζοντας με τα αποτελέσματα των μετρήσεων BDS, στα δύο δείγματα με τα χαμηλότερα ποσοστά νερού (hw = 0.29 για το Alg:NaDES και hw = 0.21 για το Alg:NaDES:Ol), ανιχνεύεται ένας μηχανισμός αποκατάστασης (Ι). Ο μηχανισμός αυτός εμφανίζεται στο ίδιο θερμοκρασιακό εύρος και στην ίδια χρονική κλίμακα και για τα δύο δείγματα και χαρακτηρίζεται από σχεδόν ταυτόσημες ενέργειες ενεργοποίησης, καθώς και από συγκρίσιμες τιμές διηλεκτρικής ισχύος. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν σαφώς κοινή φυσική προέλευση του μηχανισμού αυτού στα δύο συστήματα, η οποία αποδίδεται κατά πάσα πιθανότητα σε δευτερεύοντα μηχανισμό χαλάρωσης που σχετίζεται με τοπικές κινήσεις των πλευρικών ομάδων της πολυμερικής αλυσίδας. Για το δείγμα χωρίς εκχύλισμα παρατηρούνται δύο επιπλέον μηχανισμοί χαλάρωσης (II και III) σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Οι μηχανισμοί αυτοί χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα υψηλές τιμές διηλεκτρικής ισχύος, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν σχετίζονται με ενδογενείς μοριακές χαλαρώσεις, αλλά αποδίδονται πιθανότερα σε φαινόμενα διεπιφανειακής πόλωσης, όπως πόλωση τύπου Maxwell–Wagner–Sillars (MWS) και/ή φαινόμενα πόλωσης ηλεκτροδίων, τα οποία παρατηρούνται συχνά σε ετερογενή πολυμερικά συστήματα σε υψηλές θερμοκρασίες και χαμηλές συχνότητες. Στο δείγμα με το εκχύλισμα ανιχνεύεται ένας επιπλέον μηχανισμός χαλάρωσης (II), ο οποίος παρουσιάζει ενέργεια ενεργοποίησης παρόμοια με εκείνη του μηχανισμού I, εμφανίζεται όμως σε υψηλότερες θερμοκρασίες και χαρακτηρίζεται από ενδιάμεσες τιμές διηλεκτρικής ισχύος (Δε ~ 20–35). Επιπλέον, καταγράφονται δύο ακόμη μηχανισμοί (III και IV) σε ακόμη υψηλότερες θερμοκρασίες, συνοδευόμενοι επίσης από αυξημένες τιμές διηλεκτρικής ισχύος, ενισχύοντας την απόδοση των διεργασιών αυτών σε φαινόμενα διεπιφανειακής πόλωσης σε αυτό το θερμοκρασιακό εύρος. Περνώντας στα δείγματα με ενδιάμεσα επίπεδα υδάτωσης (hw = 0.48 για το Alg:NaDES και hw = 0.40 για το Alg:NaDES:Ol), ανιχνεύεται και στα δύο συστήματα ένας μηχανισμός χαλάρωσης που σημειώνεται ως Ice2. Ο μηχανισμός αυτός παρουσιάζει έντονες ομοιότητες ως προς την ενέργεια ενεργοποίησης, τη χρονική κλίμακα αποκατάστασης και τη διηλεκτρική ισχύ, γεγονός που υποδηλώνει ότι προέρχεται από την ίδια μοριακή διεργασία. Ο μηχανισμός εμφανίζεται σε σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες και παρουσιάζει χρονική κλίμακα αποκατάστασης μεγαλύτερη από εκείνη του κρυσταλλικού εξαγωνικού πάγου τουλάχιστον έως τους −90 °C. Αποδίδεται σε άμορφο πάγο χαμηλής πυκνότητας (low-density amorphous ice), ο οποίος χαρακτηρίζεται από αυξημένη δομική αταξία και υψηλότερη συγκέντρωση ατελειών. Στο δείγμα χωρίς εκχύλισμα παρατηρούνται επιπλέον δύο μηχανισμοί (II και III) σε υψηλότερες θερμοκρασίες, και οι δύο με μεγάλες τιμές Δε, συμβατές με φαινόμενα διεπιφανειακής πόλωσης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η συμπεριφορά του δείγματος με εκχύλισμα, όπου καταγράφονται δύο επιπλέον μηχανισμοί (II και III) εντός περίπου του ίδιου θερμοκρασιακού παραθύρου με τον μηχανισμό I, με ενέργειες ενεργοποίησης 0.70 eV και 0.51 eV, αντίστοιχα. Η συνύπαρξη πολλαπλών μηχανισμών αποκατάστασης στο ίδιο θερμοκρασιακό εύρος υποδηλώνει αυξημένη πολυπλοκότητα της δυναμικής χαλάρωσης, η οποία πιθανώς προκύπτει από τον συνδυασμό τμηματικών κινήσεων του πολυμερούς, αλληλεπιδράσεων νερού–πολυμερούς και της παρουσίας του εκχυλίσματος φύλλου ελιάς. Τέλος, στα δείγματα με τα υψηλότερα επίπεδα υδάτωσης (hw = 0.65 για το Alg:NaDES και hw = 0.71 για το Alg:NaDES:Ol). Και στα δύο συστήματα ανιχνεύεται σε χαμηλές θερμοκρασίες ένας γρήγορος αλλά σχετικά ασθενής μηχανισμός χαλάρωσης (μηχανισμός I), με ενέργεια ενεργοποίησης περίπου 0.32 eV. Ο μηχανισμός αυτός έχει παρατηρηθεί και σε άλλα συστήματα βασισμένα σε βιοπολυμερή, όπως τα Xg, Chit:NaDES και Xg–BSA, και αποδίδεται συστηματικά σε β-χαλάρωση μη κρυσταλλωμένων (ή δεσμευμένων) μορίων νερού στο κέλυφος ενυδάτωσης του πολυμερικού δικτύου. Πρόκειται για διεργασία που αναφέρεται ευρέως σε ενυδατωμένα βιοπολυμερή. Επιπλέον, και τα δύο αυτά δείγματα με την μέγιστη υδάτωση εμφανίζουν τον χαρακτηριστικό μηχανισμό διηλεκτρικής χαλάρωσης του πάγου (μηχανισμός Ice1). Ο μηχανισμός αυτός συνδέεται με σχετικά υψηλές τιμές διηλεκτρικής ισχύος (Δε ~ 30–100), συγκρίσιμες με εκείνες που έχουν αναφερθεί για κρυσταλλικό πάγο. Ωστόσο, παρατηρούνται αξιοσημείωτες αποκλίσεις στη χρονική κλίμακα αποκατάστασης σε σχέση με τον εξαγωνικό πάγο Ih, γεγονός που αντανακλά τις ισχυρές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του πάγου και του περιβάλλοντος του αλλά και την ύπαρξη ατελειών στο δομή αυτή του πάγου. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες ανιχνεύεται επιπλέον μηχανισμός χαλάρωσης (μηχανισμός II) και στα δύο δείγματα, ο οποίος χαρακτηρίζεται από υψηλές ενέργειες ενεργοποίησης. Ο μηχανισμός αυτός αποδίδεται σε μεταφορά φορτίου μεγάλης εμβέλειας και σε φαινόμενα διεπιφανειακής πόλωσης. Κλείνοντας την ανάλυση για το σύστημα αυτό και σχετικά με τους μηχανισμούς dc αγωγιμότητας μπορούμε να πούμε πως καταγράφονται και για τα δύο συστήματα δύο διαφορετικοί μηχανισμοί. Σε χαμηλές θερμοκρασίες, η dc αγωγιμότητα ακολουθεί συμπεριφορά τύπου Arrhenius, γεγονός που υποδηλώνει θερμικά ενεργοποιούμενη μεταφορά φορτίου, ελεγχόμενη από την πολυμερική μήτρα. Η συμπεριφορά αυτή είναι ιδιαίτερα εμφανής στα δείγματα υψηλής υδάτωσης (hw = 0.65 για το Alg:NaDES και hw = 0.71 για το Alg:NaDES:Ol), όπου η γραμμική συμπεριφορά Arrhenius εκτείνεται σε ευρύ θερμοκρασιακό εύρος. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες παρατηρείται σαφής απόκλιση από τη συμπεριφορά Arrhenius για τα δείγματα χαμηλής και ενδιάμεσης υδάτωσης. Η καμπυλότητα των διαγραμμάτων αγωγιμότητας περιγράφεται ικανοποιητικά από εξάρτηση τύπου Vogel–Tammann–Fulcher (VTF), αντανακλώντας μηχανισμό μεταφοράς φορτίου συνδεδεμένο με τη δομική δυναμική της μήτρας πολυμερούς–NaDES. Στο καθεστώς αυτό, η ιοντική κίνηση διευκολύνεται από τις τμηματικές αναδιατάξεις των αλυσίδων του πολυσακχαρίτη και του άμορφου μέρους του νερού, οδηγώντας σε έντονη θερμοκρασιακή εξάρτηση της σdc. Η σύγκριση μεταξύ δειγμάτων με και χωρίς εκχύλισμα φύλλου ελιάς δείχνει ότι, αν και οι βασικοί μηχανισμοί μεταφοράς παραμένουν αμετάβλητοι, η παρουσία του εκχυλίσματος οδηγεί συστηματικά σε μείωση της dc αγωγιμότητας σε όλα τα επίπεδα υδάτωσης. Για συγκρίσιμες τιμές υδάτωσης, τα δείγματα Alg:NaDES:Ol εμφανίζουν χαμηλότερες τιμές σdc και ελαφρά μετατόπιση της περιοχής VTF προς υψηλότερες θερμοκρασίες. Η συμπεριφορά αυτή υποδηλώνει ότι οι φαινολικές ενώσεις που εισάγονται μέσω του εκχυλίσματος ενισχύουν τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις και περιορίζουν την κινητικότητα των ιόντων, αυξάνοντας αποτελεσματικά τους δυναμικούς περιορισμούς της μήτρας χωρίς, ωστόσο, να καταστέλλουν τα μονοπάτια μεταφοράς φορτίου μεγάλης εμβέλειας.