Μελέτη της παθολογίας της α-synuclein κατά την ανάπτυξη του μυ weaver, γενετικού μοντέλου της νόσου Πάρκινσον

Abstract

This doctoral dissertation investigates the temporal development of potential α-synuclein pathology in the weaver (wv/wv) genetic mouse model, which is characterized by excitotoxicity and selective dopaminergic neurodegeneration in the substantia nigra (SN), recapitulating key aspects of Parkinson’s disease. Phosphorylation of α-synuclein at Serine 129 (S129) was examined in the Midbrain (MB), Striatum (STR), and Cerebral cortex (CX) across multiple age stages in weaver and wild-type mice, in relation to alterations in the local cellular microenvironment. Neuroinflammatory processes were additionally assessed in all three regions. Considering the progression of degeneration within the SN, microglial and astroglial responses were further analyzed, providing complementary insights into aging-related changes in both genotypes. A central finding of this study is the early increase in phosphorylated α-synuclein at Ser129 (phospho-S129-α-syn) in young weaver mice (P60 and P100) across all examined brain regions, as detected by Western blot analysis following biochemical fractionation. This increase was evident in both Triton-soluble and SDS-soluble fractions, while α-synuclein oligomers were not detected at either young or advanced ages, indicating that hyperphosphorylation represents an early marker of neuropathological stress rather than established protein aggregation. Notably, in older animals (P240–360), no differences in phospho-S129-α-syn levels were observed between weaver and wild-type mice in any brain region. This convergence resulted from an age-dependent increase in α-synuclein phosphorylation in wild-type mice, highlighting the role of aging in protein modification under physiological conditions, while also suggesting a limitation in the progression of α-synuclein pathology in weaver mice. Total α-synuclein expression did not differ between genotypes. Although no aggregates or inclusions were detected by immunofluorescence, phospho-S129-α-syn was localized within the nuclei of dopaminergic neurons in the SN, a finding potentially linked to responses to pronounced cellular stress. Early α-synuclein pathology in weaver mice develops within a context of severe neurodegeneration and inflammation, supporting the interpretation that it constitutes a secondary event. In the SNpc of weaver mice, massive loss of dopaminergic neurons occurs at relatively young ages (68% at P60 and 83.8% at P100). This degeneration is driven by the GIRK2 channel mutation, which induces excitotoxicity, calcium (Ca²⁺) overload, and mitochondrial dysfunction. Neurodegeneration is accompanied by a marked neuroinflammatory response in the midbrain, reflected by increased iNOS expression and by activation of microglial (Iba-1⁺) and astroglial (GFAP⁺) cells. In young weaver mice (P45, P60), microglia exhibit increased numbers and enlarged somata, indicative of a reactive phenotype that contributes to an oxidative microenvironment.A particularly notable aspect of the study is the genotype-dependent impact of aging. In wild-type mice, advancing age is associated with increased phospho-S129-α-syn levels, progressive neurodegeneration, and microglial and astroglial activation consistent with inflammaging. In contrast, weaver mice display relative stabilization. The rate of neurodegeneration decreases (or is partially compensated by neurogenesis), and levels of phospho-S129-α-syn and inflammatory markers (iNOS) in older weaver mice (P240–360) do not further escalate but converge with those of wild-type animals. Nevertheless, mild signs of glial activation persist into late middle age (P315, P360). This stabilization likely reflects a combination of early depletion of vulnerable neuronal populations and the engagement of compensatory mechanisms, including endogenous neurogenesis and improved proteostatic regulation in surviving neurons. In conclusion, this dissertation demonstrates that an adverse cellular microenvironment -characterized by excitotoxicity, oxidative stress, and elevated intracellular Ca²⁺- is sufficient to trigger early α-synuclein modifications even in the absence of protein overexpression or mutation. The weaver model thus represents a valuable tool for studying Parkinson’s disease, underscoring the multifactorial nature of its pathogenesis and the critical interplay between genetic background, homeostatic mechanisms, and aging. The findings further suggest that following an acute phase of degeneration and inflammation, the weaver brain reaches a new, albeit dysfunctional, equilibrium that limits further rapid pathological deterioration.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη διερεύνηση πιθανής παθολογίας της πρωτεΐνης α-synuclein κατά την πρόοδο της ηλικίας, στο γενετικό μοντέλο μυ weaver (wv/wv) που παρουσιάζει διεγερσιτοξικότητα και εκλεκτική ντοπαμινεργική νευροεκφύλιση στη Μέλαινα ουσία (SN), προσομοιάζοντας στη νόσο του Parkinson. Για το σκοπό αυτό, εξετάστηκε η φωσφορυλίωση (S129) της α-synuclein στο Μεσεγκέφαλο (ΜΒ), το Ραβδωτό σώμα (STR) και τον Εγκεφαλικό φλοιό (CX) σε διαφορετικές ηλικιακές φάσεις μυών weaver, αλλά και αγρίου τύπου, συναρτήσει στοιχείων του μικροπεριβάλλοντος. Στις τρεις εγκεφαλικές περιοχές εξετάστηκε επιπλέον η νευροφλεγμονή. Λαμβάνοντας υπόψιν την εξέλιξη της εκφύλισης στην SN, διερευνήθηκε η μικρογλοιακή και αστρογλοιακή απόκριση στην SN, παρέχοντας επιπρόσθετα, σημαντικές πληροφορίες σχετικές με τη γήρανση στους μύες και των δύο γονοτύπων. Κεντρικό εύρημα της μελέτης αποτελεί η πρώιμη αύξηση της φωσφορυλιωμένης (S129) α-synuclein (phospho-S129-α-syn) στους νεαρούς μύες weaver (P60 και P100) σε όλες τις εξετασθείσες περιοχές, που εντοπίστηκε μέσω Ανοσοαποτύπωσης κατά Western (WB), μετά από κλασματοποίηση των ομογενοποιημένων περιοχών. Η αύξηση αυτή εντοπίστηκε και στα δύο κλάσματα, Triton και SDS, χωρίς ωστόσο να ανιχνευθούν ολιγομερή της α-synuclein, στις νεαρές ή μεγαλύτερες ηλικίες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερφωσφορυλίωση αποτελεί πρώιμο δείκτη νευροπαθολογίας. Αξιοπρόσεκτα, στη μεγαλύτερη ηλικιακά ομάδα (P240-360) δεν εντοπίστηκαν διαφορές στη phospho-S129-α-syn ανάμεσα σε weaver και αγρίου τύπου μύες, σε καμία περιοχή. Αυτό οφείλεται στην αύξηση της φωσφορυλίωσης της α-synuclein στους μεγαλύτερους αγρίου τύπου μύες. Αναδείχθηκε έτσι, αφενός ο ρόλος της γήρανσης στην τροποποίηση πρωτεϊνών σε φυσιολογικά ζώα και αφετέρου o περιορισμός περαιτέρω παθολογίας της α-synuclein στους μύες weaver. Η έκφραση της α-synuclein συνολικά βρέθηκε ότι δε διαφέρει ανάμεσα σε weaver και αγρίου τύπου μύες. Δεν εντοπίστηκαν, μέσω Ανοσοφθορισμού (IF), συσσωρεύσεις της πρωτεΐνης ή έγκλειστα, η phospho-S129-α-syn όμως εντοπίστηκε στον πυρήνα των ντοπαμινεργικών νευρώνων της SN, εύρημα που ενδεχομένως συνδέεται με απόκριση στο έντονο κυτταρικό στρες. Η πρώιμη παθολογία της α-synuclein, αναπτύσσεται σε ένα περιβάλλον έντονης νευροεκφύλισης και φλεγμονής, υποδηλώνοντας ότι αποτελεί δευτερογενές γεγονός. Στη SNpc των weaver παρατηρείται μαζική απώλεια ντοπαμινεργικών νευρώνων σε αρκετά νεαρή ηλικία (68% στην P60 και 83,8% στην P100). Η διαδικασία οφείλεται στη μετάλλαξη του διαύλου GIRK2, η οποία πυροδοτεί διεγερσιτοξικότητα, υπερφόρτωση ασβεστίου (Ca2+) και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Η εκφύλιση συνοδεύεται από σημαντική νευροφλεγμονώδη απόκριση στο MB, με σημαντική αύξηση του δείκτη iNOS και αντίδραση των μικρογλοιακών (Iba-1+) και αστρογλοιακών (GFAP+) κυττάρων. Τα μικρογλοιακά κύτταρα στους νεαρούς weaver (P45, P60) εμφανίζουν αυξημένο αριθμό και διογκωμένο κυτταρικό σώμα, αντανακλώντας έναν αντιδραστικό φαινότυπο που συμβάλλει στο οξειδωτικό μικροπεριβάλλον. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η επίδραση της γήρανσης, η οποία διαφοροποιείται ανάλογα με τον γονότυπο. Ενώ στους μύες αγρίου τύπου η πρόοδος της ηλικίας οδηγεί σε αύξηση της phospho-S129-α-syn, νευροεκφύλιση και απόκριση μικρογλοιακή και αστρογλοιακή (inflammaging), στους μύες weaver παρατηρείται σχετική σταθεροποίηση. Ο ρυθμός της νευροεκφύλισης μειώνεται (ή και αντισταθμίζεται μερικώς από νευρογένεση), τα επίπεδα της phospho-S129-α-synuclein και της φλεγμονής (iNOS) στους μεγαλύτερους weaver (P240-360) δεν κλιμακώνονται περαιτέρω, αλλά συγκλίνουν με εκείνα των αγρίου τύπου μυών, παραμένουν ωστόσο μέχρι την (όψιμη) μέση ηλικία (P315, P360) κάποιες ενδείξεις ήπιας γλοιακής απόκρισης. Αυτή η σταθεροποίηση είναι πιθανώς σύνθετη και μπορεί να αποδοθεί εν μέρει στην πρώιμη εξάντληση των ευπαθών νευρώνων-στόχων, αλλά και στην ενεργοποίηση αντισταθμιστικών μηχανισμών, όπως η ενδογενής νευρογένεση, η καλύτερη διαχείριση της πρωτεόστασης στους επιζώντες νευρώνες. Συμπερασματικά, η διατριβή αναδεικνύει ότι ένα δυσμενές κυτταρικό μικροπεριβάλλον (διεγερσιτοξικότητα, οξειδωτικό στρες, αυξημένο ενδοκυττάριο Ca2+) αρκεί για να πυροδοτήσει πρώιμες τροποποιήσεις της α-synuclein, ακόμη και χωρίς υπερέκφραση ή μετάλλαξη της ίδιας της πρωτεΐνης. Το μοντέλο weaver αποδεικνύεται πολύτιμο για τη μελέτη της νόσου του Parkinson, υπογραμμίζοντας ότι η παθογένεια είναι πολυπαραγοντική και εξαρτάται άμεσα από την αλληλεπίδραση του γενετικού υποστρώματος με τους μηχανισμούς ομοιόστασης και τη γήρανση. Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο εγκέφαλος των weaver, μετά από μια οξεία φάση εκφύλισης και φλεγμονής, επιτυγχάνει μια νέα, έστω δυσλειτουργική, ισορροπία που περιορίζει την περαιτέρω ραγδαία επιδείνωση της παθολογίας.