Microbial food webs in experimental aquaponics and aquaculture systems

Abstract

The present thesis explores the potential role of the neglected microeukaryotic component of suspended microbial communities in experimental recirculating aquaculture and aquaponics systems by utilizing both microscopy-based and metagenomics-based approaches, while also highlighting the metabolic potential of the prokaryotic community through identifying key genes involved in the cycling of major nutrients. As global population increases there is a growing demand for food. Aquaculture production has recently surpassed the production of capture fisheries for the first time in history. Recirculating aquaculture systems (RAS) have shown promise as sustainable food production methods, especially when coupled with hydroponics set ups to form aquaponics systems. Aquaponics systems allow the simultaneous production of fish and edible plants with the benefits of minimal water usage, higher feed utilization efficiency and reduced environmental impact. Although such systems are not a new concept, their designs are undergoing constant optimization to offset their inherent drawbacks. In this context, particular interest has been shown in the bacterial communities of aquaponics biofilters (i.e., specialized compartments where prokaryotes are employed to carry out nitrification to maintain water quality), farmed fish intestines and to a lesser extent to the suspended bacterial communities in aquaponics tanks. However, the eukaryotic and archaeal fractions of microbial communities in such systems remain scarcely studied, despite playing a potentially critical part in shaping bacterial communities through predation or resource competition respectively. Furthermore, the focus on bacteria in RAS and aquaponics systems has been on nitrifying taxa, but there are other key metabolic functions such as nutrient cycling and organic matter degradation that remain unexplored. Natural abundances and growth rates of the main heterotrophic prokaryotic groups, Ciliophora (ciliates) and heterotrophic nanoflagellates (HNF), were measured using microscopic counts and in situ growth experiments after size fractionation of system water from different compartments of RAS and aquaponics systems. Natural abundances were found generally low, similar to those of rivers and oligotrophic to mesotrophic lakes. Growth rates in the aquaponics system were high, comparable to those in natural assemblages or isolated cultures. Fish tank environment allowed faster ciliate and HNF growth compared to drain tanks where water is collected after plant fertigation. Based on microscopic counts and observations, ciliate genera such as Cyclidium, Halteria, Paramecium, Litonotus, Vorticella and Euplotes were the most observed, while Oxytricha, Stylonychia and Stentor were the most abundant genera according to metagenomics sequence counts. The need for employing both methods to complement each other was also evident in other microbial groups such as amoebae which were clearly observed and identified under the microscope but not detected through metagenomics. Meanwhile, ciliate and HNF abundance was lower in the artificial seawater RAS and both populations declined during the incubation. Thus, it is implied that heterotrophic protists may be more influential over prokaryotic communities in aquaponics and less relevant in the constantly flowing, turbulent water of artificial seawater RAS.Several observations using both metagenomics and microscopy derived data indicated that fish tanks and drain tanks constituted two major niches in the aquaponics systems. Specifically, drain tanks contained an increased abundance of autotrophic groups such as diatoms (e.g., Fragilariopsis) and algae (e.g., Chlorella) likely due to higher sunlight and nutrient availability, as well as amoebae (e.g., Euglypha) and rotifers (e.g., Lecane). Drain tanks also harbored higher richness of bacterial and archaeal genera whereas fish tank microeukaryotic communities were more diverse. Furthermore, although archaeal nitrifying genera were present in all aquaponics compartments, archaeal nitrification genes were mainly present in drain tanks, likely due to the higher ammonia concentration and the presence of sludge providing them better growth conditions. Overall, NMDS and clustering analyses indicated that microeukaryotic and archaeal communities were shaped by compartment type, whereas bacterial communities were more distinct between different aquaponics systems regardless of compartment type. In fact, different bacterial genera were dominant in tomato and cucumber growing systems, with Flavobacterium and Limnohabitans being more abundant in the former and Polynucleobacter and Mycobacterium being more abundant in the latter system. Another system-wide difference was the presence of methanotrophic genera only in the samples of the parsley growing system. In terms of relevant microeukaryotic genera in aquaponics, the presence of Oxytricha, Stylonychia and Stentor in high relative abundance indicates healthy microbial community composition. In addition, both pathogen-containing genera such as Aphanomyces and Phytophthora (Oomycota) and potentially beneficial taxa for fish and plant growth such as Aspergillus (Ascomycota) and Chlorella (Chlorophyta) were detected. The identification of key prokaryotic genes involved in sulfur oxidation suggested the presence of sulfur oxidizing bacteria throughout the aquaponics systems. Carbohydrate degradation gene abundance seemed to reflect the increasing content of plant based organic matter in fish feed. Another key observation was the presence of genes responsible for anaerobic ammonia oxidation (anammox) in the mature aquaponics communities, with the implication that anammox may take place in other aquaponics compartments apart from specialized anaerobic bioreactors. The relative abundance of bacterial nitrification genes peaked in the mature communities in all systems, whereas archaeal nitrification genes were abundant in the drain tanks of the tomato growing system. In the artificial seawater RAS, ammonia oxidizing archaea dominated archaeal communities alongside methanogens, although no archaeal nitrifying genes were detected, highlighting the need for more complete genomic databases going forward with archaeal research. In addition, the RAS fish tank biofilm community was more enriched in nutrient cycling and organic matter degradation genes, as well as harboring a higher microeukaryotic diversity, implying it may serve as a hotspot for ecological processes in RAS. Several Ascomycota genera were among the dominant microeukaryotic groups in RAS fish tank water, biofilm and biofilter and may be a potential candidate for future RAS research.

Η παρούσα διατριβή διερευνά τον πιθανό ρόλο της παραμελημένης μικροευκαρυωτικής συνιστώσας των πλαγκτονικών μικροβιακών κοινοτήτων σε πειραματικά συστήματα υδατοκαλλιέργειας και ενυδρειοπονίας, χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις που βασίζονται τόσο στη μικροσκοπία όσο και στη μεταγονιδιωματική ανάλυση, ενώ παράλληλα αναδεικνύει τις μεταβολικές δυνατότητες της προκαρυωτικής κοινότητας μέσω της ταυτοποίησης κύριων γονιδίων που εμπλέκονται στον κύκλο των βασικών θρεπτικών συστατικών. Καθώς ο παγκόσμιος πληθυσμός αυξάνεται υπάρχει και αυξανόμενη ζήτηση για τρόφιμα ενώ πρόσφατα η παραγωγή μέσω υδατοκαλλιέργειας ξεπέρασε την παραγωγή μέσω αλιείας για πρώτη φορά στην ιστορία. Τα συστήματα υδατοκαλλιέργειας που στηρίζονται στην ανακύκλωση του νερού (RAS) έχουν αποδειχθεί πολλά υποσχόμενα ως μια βιώσιμη μέθοδος παραγωγής τροφίμων, ειδικά όταν συνδυάζονται με υδροπονικές εγκαταστάσεις συνιστώντας έτσι συστήματα ενυδρειοπονίας. Τα συστήματα ενυδρειοπονίας επιτρέπουν την ταυτόχρονη παραγωγή ψαριών και βρώσιμων φυτών με κύρια πλεονεκτήματα την ελάχιστη δυνατή χρήση νερού, την υψηλότερη αποδοτικότητα στην αξιοποίηση των ζωοτροφών και της μειωμένης περιβαλλοντικής επιβάρυνσης. Αν και τέτοια συστήματα δεν αποτελούν ακριβώς νέα ιδέα, ο σχεδιασμός τους βελτιστοποιείται διαρκώς για να αντισταθμιστούν τα εγγενή μειονεκτήματά τους. Σε αυτό το πλαίσιο, έχει εκδηλωθεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τις βακτηριακές κοινότητες των βιοφίλτρων (δηλαδή των εξειδικευμένων διαμερισμάτων όπου προκαρυώτες μετατρέπουν την αμμωνία σε νιτρικά ιόντα, επιτρέποντας τη διατήρηση της ποιότητας του νερού), του πεπτικού συστήματος των εκτρεφόμενων ψαριών και σε μικρότερο βαθμό για τις πλαγκτονικές βακτηριακές κοινότητες. Ωστόσο, οι ευκαρυώτες και τα αρχαία που συμπληρώνουν τις μικροβιακές κοινότητες σε τέτοια συστήματα παραμένουν ελάχιστα μελετημένα, παρά το γεγονός ότι διαδραματίζουν δυνητικά κρίσιμο ρόλο στη διαμόρφωση των βακτηριακών κοινοτήτων μέσω της θήρευσης ή του ανταγωνισμού για διαθέσιμους πόρους αντίστοιχα. Επιπλέον, οι μελέτες των βακτηρίων στα συστήματα RAS και στην ενυδρειοπονία έχουν επικεντρωθεί στις νιτροποιητικές ομάδες, αλλά υπάρχουν και άλλες βασικές μεταβολικές λειτουργίες όπως η ανακύκλωση θρεπτικών στοιχείων και η αποικοδόμηση της οργανικής ύλης που παραμένουν ελάχιστα μελετημένες. Οι φυσικές αφθονίες και οι ρυθμοί αύξησης των κύριων ετερότροφων προκαρυωτικών ομάδων, δηλαδή των εκπροσώπων του φύλου Ciliophora (βλεφαριδωτά) και των ετερότροφων νανομαστιγωτών (HNF), μετρήθηκαν μέσω τεχνικών μικροσκοπίας και in situ πειραμάτων αύξησης μετά από κλασμάτωση δειγμάτων νερού από διαφορετικά διαμερίσματα πειραματικών συστημάτων RAS και ενυδρειοπονίας. Οι φυσικές αφθονίες βρέθηκαν γενικά χαμηλές, παρόμοιες με εκείνες που καταγράφονται σε ποταμούς και σε ολιγότροφες έως μεσότροφες λίμνες. Οι ρυθμοί ανάπτυξης στο σύστημα ενυδρειοπονίας ήταν υψηλοί, συγκρίσιμοι με εκείνους σε φυσικές κοινότητες ή καθαρές καλλιέργειες. Το περιβάλλον των δεξαμενών εκτροφής των ιχθύων επέτρεψε ταχύτερη ανάπτυξη των βλεφαριδωτών και των ετερότροφων νανομαστιγωτών σε σχέση με τις δεξαμενές αποστράγγισης όπου το νερό συλλέγεται μετά το πότισμα των φυτών. Με βάση τις παρατηρήσεις και μετρήσεις μέσω μικροσκοπίας, γένη βλεφαριδωτών όπως τα Cyclidium, Halteria, Paramecium, Litonotus, Vorticella και Euplotes ήταν τα πιο συχνά παρατηρούμενα, ενώ τα Oxytricha, Stylonychia και Stentor ήταν τα πιο άφθονα γένη σύμφωνα με την συχνότητα εμφάνισης των αντίστοιχων μεταγονιδιωματικών αλληλουχιών. Η ανάγκη χρήσης και των δύο μεθόδων λόγω της συμπληρωματικότητας τους ήταν επίσης εμφανής και σε άλλες μικροβιακές ομάδες όπως οι αμοιβάδες, οι οποίες παρατηρήθηκαν και ταυτοποιήθηκαν με ευκολία μέσω μικροσκοπίας αλλά δεν ανιχνεύθηκαν μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης. Παράλληλα, η αφθονία των βλεφαριδωτών και των HNF ήταν χαμηλότερη στα RAS που λειτουργούσαν με τεχνητό θαλασσινό νερό, ενώ και οι δύο πληθυσμοί μειώθηκαν κατά την επώαση. Επομένως, φαίνεται ότι τα ετερότροφα πρώτιστα μπορεί να έχουν μεγαλύτερη επιρροή πάνω στις προκαρυωτικές κοινότητες των συστημάτων ενυδρειοπονίας και λιγότερο καθοριστικό ρόλο στο πιο τυρβώδες περιβάλλον των RAS που λειτουργούν με τεχνητό θαλασσινό νερό. Αρκετές παρατηρήσεις που βασίστηκαν σε δεδομένα της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης και της μικροσκοπίας έδειξαν ότι οι δεξαμενές εκτροφής των ψαριών και οι δεξαμενές αποστράγγισης του νερού αποτελούσαν τα δύο κύρια περιβάλλοντα στα συστήματα ενυδρειοπονίας. Συγκεκριμένα, οι δεξαμενές αποστράγγισης χαρακτηρίζονταν από αυξημένη αφθονία αυτότροφων μικροευκαρυωτών όπως διάτομα (π.χ., Fragilariopsis) και φύκη (π.χ., Chlorella) πιθανώς λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης θρεπτικών και έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία, αλλά και αμοιβάδες (π.χ., Euglypha) και τροχοφόρα (π.χ., Lecane). Οι δεξαμενές αποστράγγισης φιλοξενούσαν επίσης μεγαλύτερο αριθμό γενών στις περιπτώσεις των βακτηρίων και των αρχαίων, ενώ οι μικροευκαρυωτικές κοινότητες των δεξαμενών εκτροφής των ψαριών είχαν μεγαλύτερη ποικιλότητα. Επιπλέον, αν και νιτροποιητικά γένη αρχαίων ήταν παρόντα σε όλα τα διαμερίσματα των συστημάτων ενυδρειοπονίας, τα νιτροποιητικά γονίδια των αρχαίων ανιχνεύτηκαν κυρίως στις δεξαμενές αποστράγγισης, πιθανώς λόγω της υψηλότερης συγκέντρωσης αμμωνίας και της ύπαρξης σωματιδιακής ύλης που πιθανώς προσεφέρουν ένα πιο ευνοϊκό περιβάλλον για την αύξηση των νιτροποιητικών αρχαίων. Συνολικά, οι αναλύσεις NMDS και συσταδοποίησης έδειξαν ότι οι κοινότητες των μικροευκαρυωτών και αρχαίων διαμορφώνονταν ανάλογα με τον τύπο του διαμερίσματος, ενώ οι βακτηριακές κοινότητες ήταν πιο διακριτές μεταξύ διαφορετικών συστημάτων ενυδρειοπονίας ανεξάρτητα από τον τύπο του διαμερίσματος. Πράγματι, διαφορετικά βακτηριακά γένη κυριαρχούσαν στα συστήματα καλλιέργειας ντομάτας και αγγουριού, με τα Flavobacterium και Limnohabitans να είναι πιο άφθονα στο πρώτο και τα Polynucleobacter και Mycobacterium να είναι πιο άφθονα στο δεύτερο σύστημα. Μια άλλη διαφορά μεταξύ ολόκληρων συστημάτων ήταν η παρουσία μεθανότροφων βακτηριακών γενών μόνο στα δείγματα του συστήματος καλλιέργειας μαϊντανού.Όσον αφορά τα σημαντικά μικροευκαρυωτικά γένη στην ενυδρειοπονία, η παρουσία των Oxytricha, Stylonychia και Stentor σε υψηλή αφθονία υποδήλωνε την υγιή σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν τόσο γένη που περιέχουν παθογόνα στελέχη όπως τα Aphanomyces και Phytophthora (Oomycota) αλλά και δυνητικά ωφέλιμα για την ανάπτυξη ψαριών και φυτών όπως τα Aspergillus (Ascomycota) και Chlorella (Chlorophyta). Η ταυτοποίηση κύριων προκαρυωτικών γονιδίων που εμπλέκονται στην οξείδωση θειικών ενώσεων υποδηλώνει την παρουσία θειοξειδωτικών βακτηρίων σε όλα τα διαμερίσματα των συστημάτων ενυδρειοπονίας. Η αφθονία των γονιδίων που σχετίζονται με την αποικοδόμηση υδατανθράκων φάνηκε να αντανακλά την αυξανόμενη περιεκτικότητα οργανικής ύλης φυτικής προέλευσης στις ιχθυοτροφές. Μια άλλη βασική παρατήρηση ήταν η παρουσία γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την αναερόβια οξείδωση αμμωνίας (anammox) στις ώριμες μικροβιακές κοινότητες των συστημάτων ενυδρειοπονίας, με το συμπέρασμα ότι η διαδικασία anammox μπορεί να λαμβάνει χώρα και σε άλλα διαμερίσματα των συστημάτων ενυδρειοπονίας εκτός από τους εξειδικευμένους αναερόβιους βιοαντιδραστήρες. Η σχετική αφθονία των βακτηριακών νιτροποιητικών γονιδίων έφτασε στις μέγιστες τιμές της στις ώριμες κοινότητες σε όλα τα συστήματα, ενώ τα νιτροποιητικά γονίδια των αρχαίων ήταν πιο άφθονα στις δεξαμενές αποστράγγισης του συστήματος καλλιέργειας ντομάτας. Στην περίπτωση των RAS που λειτουργούσαν με τεχνητό θαλασσινό νερό, τα αμμωνιοξειδωτικά αρχαία κυριάρχησαν στις κοινότητές τους παράλληλα με μεθανογόνα γένη, αν και δεν ανιχνεύθηκαν νιτροποιητικά γονίδια αρχαίων, γεγονός που υπογραμμίζει την ανάγκη για πιο ολοκληρωμένες γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων για μελλοντικές έρευνες πάνω στα αρχαία. Επιπλέον, η βακτηριακή κοινότητα των βιοϋμενίων στις δεξαμενές εκτροφής των ψαριών στα RAS ήταν πιο εμπλουτισμένη σε γονίδια που συμμετέχουν στην ανακύκλωση θρεπτικών συστατικών και στην αποικοδόμηση οργανικής ύλης, ενώ η αντίστοιχη μικροευκαρυωτική κοινότητα παρουσίαζε και υψηλότερη ποικιλομορφία, υποδηλώνοντας ότι τα βιοϋμένια αυτά μπορεί να είναι σημείο κλειδί για πολλές οικολογικές διεργασίες στα RAS. Ακόμη, αρκετά γένη του φύλου Ascomycota ήταν μεταξύ των κυρίαρχων μικροευκαρυωτικών ταξινομικών ομάδων στο νερό, τα βιοϋμένια και το βιοφίλτρο των RAS και επομένως το φύλο αυτό πιθανώς χρήζει μελλοντικής έρευνας στο πλαίσιο των RAS.