Development of biographene-based nanobiocatalytic systems for their application in bioprocesses

Abstract

The increasing demand for sustainable industrial processes has intensified the search for environmentally benign technologies that minimize energy consumption, toxic waste generation, and reliance on non-renewable resources. In this context, the convergence of biotechnology and nanotechnology has emerged as a powerful interdisciplinary approach capable of addressing key global challenges in energy, environment, healthcare, and industrial manufacturing. Among nanomaterials, carbon-based nanomaterials, particularly graphene, have attracted significant attention due to their exceptional mechanical strength, high surface area, electrical conductivity, and chemical stability. However, conventional synthetic routes to graphene often rely on harsh chemicals, high-energy inputs, and environmentally hazardous reagents, which contradict the principles of green chemistry. This has motivated the exploration of eco-friendly synthesis methods, including liquid-phase exfoliation with green solvents, sonication techniques, and bio-derived exfoliating and stabilizing agents. These approaches not only reduce environmental impact but also enhance the scalability and biocompatibility of the resulting nanomaterials. A promising advancement in this direction is the development of bio-Graphene, a green carbon alternative synthesized via sustainable routes that use biological precursors or processes. Bio-Graphene combines the desirable physicochemical properties of graphene with improved biocompatibility, reduced toxicity, and environmentally responsible production. Biologically derived exfoliating and stabilizing agents, including bovine serum albumin (BSA), chitosan, and plant extracts, have enabled the eco-friendly synthesis of few-layer bio-Graphene materials with high dispersibility, biocompatibility, and controlled surface functionality. The introduction of functional groups via BSA served a dual role, facilitating graphene exfoliation while providing reactive sites for enzyme conjugation. The resulting bio-Graphene exhibited favorable physicochemical properties, including a high surface area, abundant functional groups, and stable aqueous suspensions. Bio-Graphene was successfully employed for the covalent co-immobilization of β-glucosidase, glucose oxidase, and horseradish peroxidase, resulting in a robust tri-enzymatic nanobiocatalyst capable of performing multi-step cascade reactions. This system demonstrated enhanced thermal stability and reusability compared to free enzymes, highlighting the potential of bio-Graphene for biosensing and synthetic biocatalytic applications. The biocompatible interface of bio-Graphene was further evaluated in comparison with conventional carbon nanomaterials, specifically multi-walled carbon nanotubes, for glucose biosensor development. Structural and kinetic studies revealed that bio-Graphene preserved the secondary structure and catalytic activity of glucose oxidase, whereas MWCNTs induced conformational alterations and reduced enzymatic performance. These findings were reflected in biosensor operation, where bio-Graphene–based devices exhibited superior sensitivity, reproducibility, and analytical performance, underscoring the importance of nanomaterial surface chemistry and hydrophilicity in enzyme-based electrochemical systems.Building upon these findings, magnetic bio-Graphene was synthesized via a green, sustainable approach using olive leaf extract as a natural reducing and stabilizing agent. The resulting magnetic nanomaterial combined high surface area, rich surface functionalization, and excellent magnetic recoverability. Magnetic bio-Graphene served as an effective support for the co-immobilization of cellulase and β-glucosidase, yielding a bi-enzymatic nanobiocatalyst with enhanced synergistic activity, operational stability, and recyclability. Its successful integration into continuous-flow microreactors with magnetic confinement represents a significant advancement toward intensified and controllable bioprocessing platforms. The applicability of magnetic bio-Graphene-based nanobiocatalysts was further demonstrated in the valorization of agro-industrial waste, specifically pomegranate peels. Co-immobilized cellulase and pectinase enabled efficient ultrasound-assisted extraction of bioactive phenolic compounds, producing extracts with enhanced antioxidant, antimicrobial, and antidiabetic properties. Additionally, these extracts were utilized for the green synthesis of silver nanoparticles with superior bactericidal activity, highlighting the multifunctionality and circular-economy potential of the developed systems. Finally, bio-Graphene was incorporated into polymeric ultrafiltration membranes, where it acted as both a hydrophilicity-enhancing and antimicrobial agent. The synergistic integration of bio-Graphene with chitosan and hydrolytic enzymes (lysozyme and α-amylase) produced biocatalytic nanocomposite membranes with improved antifouling resistance, antimicrobial performance, and long-term stability under realistic wastewater treatment conditions. Overall, this work demonstrates that green-synthesized bio-Graphene-based nanomaterials represent powerful and sustainable alternatives to conventional nanomaterials, effectively bridging nanotechnology and biotechnology for next-generation industrial and environmental applications.

Η αυξανόμενη ζήτηση για βιώσιμες βιομηχανικές διεργασίες έχει εντείνει την αναζήτηση περιβαλλοντικά φιλικών τεχνολογιών που ελαχιστοποιούν την κατανάλωση ενέργειας, τη δημιουργία τοξικών αποβλήτων και την εξάρτηση από μη ανανεώσιμους πόρους. Σε αυτό το πλαίσιο, ο συνδυασμός της βιοτεχνολογίας και της νανοτεχνολογίας έχει αναδειχθεί σε μια ισχυρή διεπιστημονική προσέγγιση, ικανή να αντιμετωπίσει βασικές παγκόσμιες προκλήσεις στους τομείς της ενέργειας, του περιβάλλοντος, της υγείας και της βιομηχανικής παραγωγής. Μεταξύ των νανοϋλικών, τα νανοϋλικά άνθρακα και ιδιαίτερα το γραφένιο έχουν προσελκύσει ιδιαίτερο επιστημονικό ενδιαφέρον λόγω της εξαιρετικής μηχανικής αντοχής, της υψηλής ειδικής επιφάνειας, της ηλεκτρικής αγωγιμότητας και της χημικής τους σταθερότητας. Ωστόσο, οι συμβατικές συνθετικές μέθοδοι παραγωγής γραφενίου βασίζονται συχνά στη χρήση υψηλών ενεργειακών απαιτήσεων και περιβαλλοντικά επικίνδυνων αντιδραστηρίων, γεγονός που έρχεται σε αντίθεση με τις αρχές της πράσινης χημείας. Αυτό έχει οδηγήσει στη διερεύνηση φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων σύνθεσης, όπως η αποφυλλοποίηση σε υγρή φάση με πράσινους διαλύτες, υποβοηθούμενη πολλές φορές από τη χρήση υπερήχων και η χρήση βιολογικής προέλευσης αποφυλλοποιητικών και σταθεροποιητικών παραγόντων. Οι προσεγγίσεις αυτές όχι μόνο μειώνουν το περιβαλλοντικό αποτύπωμα, αλλά παράλληλα ενισχύουν τη βιοσυμβατότητα των παραγόμενων νανοϋλικών. Μια ιδιαίτερα υποσχόμενη εξέλιξη προς αυτή την κατεύθυνση είναι η ανάπτυξη του βιο-γραφενίου, ενός πράσινου εναλλακτικού νανοϋλικού άνθρακα που συντίθεται μέσω βιώσιμων μεθόδων, με χρήση βιολογικών πρόδρομων υλικών ή διεργασιών. Το βιο-γραφένιο συνδυάζει τις επιθυμητές φυσικοχημικές ιδιότητες του γραφενίου με βελτιωμένη βιοσυμβατότητα, μειωμένη τοξικότητα και φιλική προς το περιβάλλον σύνθεση. Βιολογικής προέλευσης αποφυλλοποιητικοί και σταθεροποιητικοί παράγοντες, όπως η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA), η χιτοζάνη και φυτικά εκχυλίσματα, επιτρέπουν την πράσινη σύνθεση βιο-γραφενίου με υψηλή υδροφιλικότητα, βιοσυμβατότητα και ελεγχόμενη επιφανειακή λειτουργικότητα. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, η εισαγωγή λειτουργικών ομάδων μέσω της BSA επιτέλεσε διπλό ρόλο, διευκολύνοντας την αποφυλλοποίηση του γραφίτη, παρέχοντας ενεργές θέσεις για την ακινητοποίηση ενζύμων. Το παραγόμενο βιο-γραφένιο παρουσίασε ευνοϊκές φυσικοχημικές ιδιότητες, όπως υψηλή ειδική επιφάνεια, άφθονες λειτουργικές ομάδες και υψηλή υδροφιλικότητα. Το βιο-γραφένιο χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς στη συνέχεια, για την ομοιοπολική συν-ακινητοποίηση της β-γλυκοσιδάσης, της οξειδάσεις της γλυκόζης και της υπεροξειδάσης του χρένου, οδηγώντας στη δημιουργία ενός ανθεκτικού τριενζυμικού νανοβιοκαταλύτη, ικανού να επιτελεί αντιδράσεις καταρράκτη. Το σύστημα αυτό εμφάνισε επίσης, αυξημένη θερμική σταθερότητα και επαναχρησιμοποίηση σε σύγκριση με τα ελεύθερα ένζυμα, αναδεικνύοντας το δυναμικό του βιο-γραφενίου σε εφαρμογές βιοαισθητήρων και συνθετικής βιοκατάλυσης. Η βιοσυμβατή διεπιφάνεια του βιο-γραφενίου αξιολογήθηκε περαιτέρω σε σύγκριση με συμβατικά νανοϋλικά άνθρακα, συγκεκριμένα νανοσωλήνες άνθρακα (MWCNTs), για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων γλυκόζης. Δομικές και κινητικές μελέτες έδειξαν ότι το βιο-γραφένιο διατήρησε τη δευτεροταγή δομή και την καταλυτική δραστικότητα της οξειδάσης της γλυκόζης, ενώ οι MWCNTs προκάλεσαν αλλοιώσεις στη διαμόρφωση του ενζύμου και μείωση της ενζυμικής δραστικότητας. Τα ευρήματα αυτά αποτυπώθηκαν και σε βιοαισθητήρες, όπου οι συσκευές βασισμένες σε βιο-γραφένιο παρουσίασαν ανώτερη ευαισθησία, επαναληψιμότητα και αναλυτική απόδοση, υπογραμμίζοντας τη σημασία της πράσινης χημείας στη σύνθεση των νανοϋλικών για τη δημιουργία ενός ιδανικού περιβάλλοντος ακινητοποίησης ενζύμων και την ενίσχυση της δραστικότητάς τους σε ηλεκτροχημικά συστήματα. Στο επόμενο κεφάλαιο της διδακτορικής διατριβής, συντέθηκε μαγνητικό βιο-γραφένιο μέσω μιας πράσινης και βιώσιμης μεθόδου, χρησιμοποιώντας εκχύλισμα φύλλων ελιάς ως φυσικό αναγωγικό και σταθεροποιητικό παράγοντα. Το μαγνητικό νανοϋλικό που προέκυψε συνδύασε την υψηλή ειδική επιφάνεια του βιο-γραφενίου, και την εξαιρετικές μαγνητικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων σιδήρου που συντέθηκαν στην επιφάνεια του. Το μαγνητικό βιο-γραφένιο ήταν αποτελεσματικός φορέας για τη συν-ακινητοποίηση της κυτταρινάσης και της β-γλυκοσιδάσης, οδηγώντας σε έναν διενζυμικό νανοβιοκαταλύτη με ενισχυμένη συνεργιστική δράση, λειτουργική σταθερότητα και δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης. Η επιτυχής ενσωμάτωσή του σε μικροαντιδραστήρες συνεχούς ροής με μαγνητικό εγκλωβισμό αποτελεί σημαντική πρόοδο για τα ενζυμικά μαγνητικά συστήματα συνεχούς ροής. Μαγνητικοί νανοβιοκαταλύτες εφαρμόστηκαν και στην αξιοποίηση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων, και συγκεκριμένα των φλοιών ροδιού. Η συν-ακινητοποίηση της κυτταρινάσης και της πηκτινάσης στο μαγνητικό υλικό επέτρεψε την αποτελεσματική εκχύλιση βιοδραστικών φαινολικών ενώσεων υποβοηθούμενη και από υπερήχους, οδηγώντας σε εκχυλίσματα με ενισχυμένες αντιοξειδωτικές, αντιμικροβιακές και αντιδιαβητικές ιδιότητες. Επιπλέον, τα εκχυλίσματα αυτά αξιοποιήθηκαν για την πράσινη σύνθεση νανοσωματιδίων αργύρου με υψηλή βακτηριοκτόνο δράση, αναδεικνύοντας την πολυλειτουργικότητα και το δυναμικό κυκλικής οικονομίας των ανεπτυγμένων αυτών συστημάτων. Τέλος, το βιο-γραφένιο ενσωματώθηκε σε πολυμερικές μεμβράνες υπερδιήθησης, όπου λειτούργησε τόσο ως παράγοντας αύξησης της υδροφιλικότητας όσο και ως αντιμικροβιακός παράγοντας. Η συνεργιστική ενσωμάτωση του βιο-γραφενίου με χιτοζάνη και υδρολυτικά ένζυμα (λυσοζύμη και α-αμυλάση) οδήγησε στη δημιουργία βιοκαταλυτικών νανοσύνθετων μεμβρανών με βελτιωμένη αντοχή στη ρύπανση (antifouling), αντιμικροβιακή απόδοση και μακροχρόνια σταθερότητα υπό ρεαλιστικές συνθήκες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων. Συνολικά, η παρούσα εργασία καταδεικνύει ότι τα νανοϋλικά βιο-γραφενίου που συντίθενται μέσω πράσινων μεθόδων αποτελούν ισχυρές και βιώσιμες εναλλακτικές λύσεις έναντι των συμβατικών νανοϋλικών, γεφυρώνοντας αποτελεσματικά τη νανοτεχνολογία και τη βιοτεχνολογία για εφαρμογές στη βιομηχανία και το περιβάλλον.